Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Алфредо Элдер 1 Вершинина В.И. 1 Хаертынов К.С. 2 Герасимова С.В. 2 Уразов Н.Г. 3 Хаертынова И.М. 2

---

1 ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет

2 ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России

3 ГАУЗ «Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями МЗ РТ3»

В настоящей работе описан метод получения из клеток M. tuberculosis антигенного препарата с молекулярной массой 45 кДа, обладающей серологической активностью с сыворотками больных с установленным диагнозом туберкулеза в реакциях иммуноблоттинг. Данный результат предполагает, что на полученном антигене проявляется 100 % чувствительность, что вызывает определенные сомнения. По литературным данным известно, что 100 % противотуберкулезные антитела (ПТАТ) выявляются только при фиброзно-кавернозном туберкулезе и при бактериовыделении [13], во всех остальных формах туберкулеза процент выявляемости ПТАТ был значительно ниже. Таким образом, в результате проведенной работы из клеток M. tuberculosis был получен антигенный препарат с молекулярной массой 45 кДа, который содержит менее 5 % балластных белков. Предположительно этот антиген представляет собой гликопротеин, локализованный на поверхности бактериальной клетки. Данное предположение основывается на щадящем приеме обработки бактериальных клеток (10 % водный раствор-ДМСО) и на сходстве молекулярных масс 45–47 кДа антигенного комплекса

Статья в формате PDF

478 KB

антиген

микобактерия туберкулез

иммуноблоттинг

1. Адамбеков Д.А., Курманов Р.А., Баенский А.В., Литвинов В.И. Диагностическое значение изучения специ­фического противотуберкулезного иммунитета у больных при туберкулезе и другой легочной патологии. // Проблемы туберкулеза. – 1997. – № 3. – С. 20–22.

2. Гладкова С.Е., Решетников С.С., Пряхина В.Н. Опыт применения тест-системы «АТ-Туб-Бест» для диагностики туберкулеза. // Новости «Вектор-Бест». – 2006. – № 4 (42). – С. 2–4.

3. Карпов А.В. Сравнительная эффективность раннего выявления туберкулеза иммунологическими методами // Вестник Новгородского государственного университета. – 1998.

4. Чуканов В.И., Слогоцкая Л.В. Особенности диагностики и эффективность лечения больных туберкулезом легких без бактериовыделения. // Проблемы туберкулеза и болезней легких. – 2007. – № 11. – С. 22–25.

5. Diagbouga S., Fumoux F., Zoubga A., Sanou P.T., Marchal G. Immunoblot analysis for Serodiagnosis of tuberculosis Using a 45/47- Kilodalton Antigen Complex of Mycobacterium tuberculosis. // Clinical and Diagnostic Laboratory immunology. – 1997, May. – Vol. 4, № 3. – Р. 334–338.

6. Houghton R.L., Lodes M.J., Dillon D.C., Reynolds L.D., day C.H., McNeill P.D., Hendrickson R.C., Skkeiky Y.A.W., Sampaio D.P., Bararo R., Lyashchenko K.P., Reed S.G. Use of Multiepitope Polyproteins in Serodiagnosis of Actiye Tuberculosis. // Clin diagn Lab Immmmunol. – 2002 july. – № 9(4). – С. 883–891.5

7. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the bacteriophage T4. – Nature, London, 1970. – Vol. 227. – Р. 680–685.

8. Mukherjee S., Daifalla N., Zhang Y., Douglass J., Brooks L., Vedvick T., Houghton R., Reed S.G., Campos-neto A. Potential Serological Use of a Recombinant Protein That Is a Replica of a Mycobacterium tuberculosis Protein Found in the Urine of Infected Mice. // Clin diagn Lab Immmmunol. – 2004 March. – № 11(2). – Р. 280–286

9. Roman F., Horn C., Pescher P., Namane A., Riviere M., Puzo G., Barzu O. and Marchal G. Deglycosylation of the 45/47 Kilodalton Antigen Complex of Mycobacterium tuberculosis Decreases Its Capacity To Elicit In Vivo or In Vitro Cellular Immune Responses // Infection and Immunity. – 1999. – Vol. 67, № 11. – P. 5567–5572.

10. Towbin H., Stähein T. and Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350, 1979.

11. Waters W.R., Palmer M.V., Bannantine J.P., Whipple D.L., Greenwald R., Esfandiari J., Andersen P., McNair J., Pollock J/M., Lyashchenko K.P. Antigen recognition by serum antibodies in white-tailed deer (Odocoileus virginianus) experimentally infected with Mycobacterium bovis // Clin diagn Lab Immmmunol. – 2004 September. – № 11(5). – P. 849–855.

Серологические методы наиболее удобны для диагностики инфекционных болезней, так как для анализа используется легко доступный клинический материал: сыворотка или плазма крови человека. Однако эти методы, включая метод ИФА, не обладают достаточной чувствительностью для диагностики туберкулеза [2]. Так, при использовании препарата, выделенного из клеточных стенок микобактерий H37Rv и содержащего антиген с молекулярной массой 38–42 кДа, противотуберкулезные антитела (ПТАТ) были выявлены только у 76,7 % больных туберкулемой и у 70,0 % больных инфильтративным туберкулезом [1]. При использовании антигенного комплекса с молекулярной массой 45–47 кДа чувствительность метода составила 40 % [5]. На использованных в недавнем прошлом антигенных препаратах у лиц с установленным диагнозом туберкулез противотуберкулезные антитела (ПТАТ) обнаруживаются в 100 % случаях только при фиброзно-кавернозном туберкулезе и при бактериовыделении [3]. Однако пациенты с фиброзно-кавернозной формой заболевания составляют небольшую часть общего количества больных туберкулезом. При очаговом туберкулезе ПТАТ обнаруживают только в 31 % случаев, а при туберкулезе бронхов − в 15,5 % случаев [3]. По данным Чуканова В.И. и соавт. ПТАТ выявляют у больных туберкулезом в среднем в 71 % случаев [4].

При использовании отдельных рекомбинантных антигенов Mycobacterium tuberculosis выявляемость ПТАТ в сыворотках больных туберкулезом за исключением ВИЧ-инфицированных пациентов также невысока − около 60 % [8]. Есть данные, что использование набора значительного количества рекомбинантных антигенов приводит к улучшению результата: ПТАТ выявляли у 93 % больных туберкулезом [6,11].

Цель настоящей работы заключалась в получении антигенного препарата из Mycobacterium tuberculosis, который отличался бы высокой активностью и специ­фичностью.

Материалы и методы исследования

Культуру Mycobacterium tuberculosis штамм «Академия», выращивали на твердой питательной среде Левенштейна-Йенсена в течение 40–60 дней, затем переносили в жидкую питательную среду Сотона. Наращивание бактериальной массы в последней проводили в аппарате «Bacteck» при 37 °С в течение 7–10 суток.

Антигенный препараты из Mycobacterium tuberculosis получали обработкой бактериальных клеток 10 % диметилсульфоксидом (ДМСО) с последующей дез­интеграцией стеклянными шариками в гемогенизаторе.

Белковые фракции исходного, промежуточного и конечного препаратов выявляли с помощью электрофореза в 12,5 % полиакриламидном геле (ПААГ) по Леммли [7].

Для определения молекулярной массы антигенов использовали набор белков «Broad Range» (BIO-RAD).

Гель-фильтрацию выполняли на колонках размером 2×100 см, заполненных соответственно сефадексами G-200.

Полученные антигенные препараты анализировали с помощью иммуноблотинга [10]. Иммуноблотинг выполняли по методике, описанной в инструкции к набору «NEW LAV BLOT 1» (BIO-RAD).

Результаты исследования и их обсуждение

Бактериальные клетки, выращенные на среде Сотона, осаждали центрифугированием в течение 30 минут при 8000 g и трижды промывали фосфатным буфером (рН 7,4) с 0,15 М NaCl. Клетки суспендировали в 10 % водном растворе ДМСО и в течение 30 минут гомогенизировали. Гомогенат подвергали исчерпывающему диализу против дистиллированной воды в течение ночи против 0,05 М трис-НCl буфера с рН 7,4–7,6. Центрифугированием в течение 30 минут при 8000 g освобождались от обломков клеток. Полученный ДМСО-экстракт служил в дальнейшим исходным материалом для получения антигенных препаратов из Mycobacterium tuberculosis.

Для выделения антигенных фракций ДМСО-экстракты использовали различные подходы: экстракция растворителями при различных значениях рН, высаливание, а также метод гель-фильтрации.

На первом этапе очистки рН ДМСО-экстракта доводили до значения 3,5–4,0 уксусной кислотой и выдерживали в течение 24 часов при температуре 4 °С. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 8000 g в течение 20 минут. Осадок растворяли 0,05 М трис-НCl (рН 7,4–7,6) в 1/2 первоначального объема, ДМСО-экстракта рН доводили 2 М раствором NaOH до значения 7,4–7,6.

Способы получение антигенных препаратов Mycobacterium tuberculosis

Иммуноблоты, полученные на материале осадка и супернатанта, представлены на рис. 1 (а и б соответственно). Их анализ показывает, что спектры серопозитивных фракций осадка и супернатанта мало чем отличаются между собой. В тоже время легко заметить индивидуальные различия в спектрах серопозитивных фракций, которые проявляются с сыворотками 4 больных туберкулезом. Наибольшая вариабельность по серологической активности наблюдается для белков, имеющих молекулярные массы 11–13,5; 15,5–22; 24,5–30 и 53 кДа. Что касается белков с молекулярной массой 45 кДа, то антиген к ним встречается во всех исследуемых сыворотках. Следует отметить, что белки с молекулярной массой 45 кДа более полно представлены в препаратах, полученных на основе супернатантов.

Рис. 1. Иммуноблотинги антигенных препаратов Mycobacterium tuberculosis, полученных разными способами, с сыворотками больных туберкулезом

Поэтому было проведено дополнительное осаждение супернатанта 30 % этанолом. Из рис. 1, в видно полученные в результате осаждения этанола белки обладали выраженной серологической активностью. Обращает внимание тот факт, что сыворотка пациента № 1 весьма активно реагирует с фракциями в диапазоне М.м. 31 – 200 кДа, а сыворотка больного № 4 с белками мажорной фракции с М.М. 24,5 кДа.

Анализ антигенного спектра препарата Г свидетельствует о том, что большая доля серологической активности приходится на белки с низкой массой 6,5 кДа и на белки с молекулярной массой более 45 кДа.

В препаратах Д, полученных из того же супернатанта при внесении в него 70 % этанола, спектр серопозитивных фракций мало отличался от антигенного спектра препарата Г. Исключение представлял спектр серопозитивных фракций пациента № 2. В его сыворотке присутствуют антитела, с которыми активно реагируют белки, имеющие молекулярную массу 18 и 19,5 кДа. Дополнительное осаждение сульфатом аммония не повлияло на антигенное состояние препарата.

Ввиду своеобразного распределения активности, которая в основном располагалась в области молекулярных масс более 45 кДа и менее 1 кДа, для дальнейшей очистки использовали метод гель-фильтрации.

Гель-фильтрацию сульфат-аммонийного осадка проводили на колонках 2×100 см с сефадексами G-200. Материал элюировался двумя пиками.

Рис. 2. Электрофорез антигенного препарата в 12,5 % ПААГ (по Леммли). Локализацию белковых фракций выявляли, используя краситель Кумасси ярко-голубой G-250

На рис. 2 представлена электрофореграмма материала 1 пика, которая свидетельствует о достаточной однородности препарата. Следует отметить, что при окрашивании белков, фракционированных в геле, азотнокислым серебром обнаруживаются минорные фракции, на долю которых приходится менее 5 % от общего количества белка.

На рис. 3 представлены иммуноблоты, полученные на материале первого пика с 24 сыворотками пациентов больных туберкулезом легких. Видно, что на всех иммуноблотах весьма четко представлена одна серопозитивная фракция с молекулярной массой в 45 кДа.

Следует отметить, что в этом эксперименте использовали произвольно взятые сыворотки пациентов больных легочной формой туберкулеза. Данный результат предполагает, что на полученном антигене проявляется 100 % чувствительность, что вызывает определенные сомнения. По литературным данным известно, что 100 % противотуберкулезные антитела (ПТАТ) выявляются только при фиброзно-кавернозном туберкулезе и при бактериовыделении [10], во всех остальных формах туберкулеза процент выявляемости ПТАТ был значительно ниже.

Рис. 3. Иммуноблоты, полученные на антигене 45 кДа с 24 сыворотками больных туберкулезом легких

Таким образом, в результате проведенной работы из клеток M. tuberculosis был получен антигенный препарат с молекулярной массой 45 кДа, который содержит менее 5 % балластных белков. Предположительно этот антиген представляет собой гликопротеин, локализованный на поверхности бактериальной клетки. Данное предположение основывается на щадящем приеме обработки бактериальных клеток (10 % водный раствор-ДМСО) и на сходстве молекулярных масс 45–47 кДа антигенного комплекса, описанного в статьях [5, 9].

Вывод

Предложен способ выделения серологических активных антигенных с молекулярной массой 45 кДа из M. tuberculosis штамм «Академия» включают обработку клеток 10 % раствором ДМСО с осаждением и фракционированием супернатанта уксусной кислотой, этанолом и хромотографией на сефадефа g-200

Белок с молекулярной массой 45 кДа обладал выраженной серологической активностью в реакциях иммуноблотинга сыворотками больных с установленным диагнозом туберкулеза.

Рецензенты:

Ильинская О.Н., д.б.н., профессор кафедры биохимии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», г. Казань;

Коксин В.П., д.х.н., старший научный сотрудник лаборатории Республиканского центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями, г. Казань.

Работа поступила в редакцию 26.11.2012.

Библиографическая ссылка