Несмотря на обилие имеющихся на фармацевтическом рынке лекарственных средств для местного лечения раневых и воспалительных процессов, приходится констатировать, что желаемая степень терапевтического эффекта до сих пор не достигнута [1, 4, 5]. В последнее десятилетие отмечается возрастающий интерес к средствам растительного происхождения, что объясняется наличием широкого спектра фармакологического действия, мягко и гармонично воздействующего на все системы организма при минимальном количестве побочных эффектов в условиях длительного применения, а также экономичностью.
Рациональное лечение ран – одна из наиболее острых и сложных проблем современной медицинской практики. На сегодняшний день ни один из методов лечения ран с использованием лекарственных средств не является универсальным, надежным, в полной мере удовлетворяющим клиницистов. Этиология и патогенез раневого процесса делают необходимым дифференцировать подход к созданию лекарственных форм для местного лечения раневой патологии [3,5].
Цель: изучить биологическую активность фитогеля оригинального состава.
Материалы и методы исследования
На первом этапе исследования были сконструированы 5 композиций из густых экстрактов чабреца, каштана, солодки, крапивы, масляного экстракта зверобоя и дигидрокверцетина. Композиции отличались долевыми соотношениями каждого из компонентов.
В качестве биологических объектов использовали культуру клеток Parametium caudatum и белых крыс линии Вистар. Parametium caudatum легко культивировать и при исследовании ее роста и размножения возможно быстро получить большой объем цифровой информации [2, 4]. Для культивирования парамеций использовали среду Лозина-Лозинского при рН водной среды 6,2–7,8 и температурном оптимуме 20–26 °С. Пищей для парамеций служили живые дрожжи – Rhadotorula gracilis с добавлением пшеничной муки. Для определения чувствительности парамеций на предметное стекло наносили две капли среды (число парамеций в каждой капле не менее 5 особей), одна капля служила контролем, ко второй тангенциально наносили каплю соответствующего объема 0,9 % раствора натрия хлорида. При этом парамеции считаются чувствительными в случае ускорения движения не более 4 особей из 5 по результатам 5 измерений. Двигательная активность парамеций во многом формируется на основе работы ионных каналов, встроенных в мембрану ресничек, и является характеристикой, отражающей функциональное состояние клетки [2]. При этом Parametium caudatum функционирует в направлении сохранения мембранного потенциала. В результате снижения мембранного потенциала клетки двигаются медленнее или вращаются на месте вокруг одного конца. Для оценки чувствительности по параметру – замедление движений – использовали 0,5 %-й раствор калия хлорида и проводили опыты по аналогичной методике. При этом парамеции считаются чувствительными в случае замедления движения не менее 4 особей из 5 по сравнению с контролем. Для изучения протективного (антиоксидантного и мембраностабилизирующего) действия исследуемых композиций оценивали их влияние на продолжительность периода активности инфузорий в среде с добавлением токсических веществ: 1 %-й раствор водорода пероксида (токсикант, который in vivo расщепляется до перекисных радикалов и повреждает преимущественно липидную часть мембраны) и 14 %-й этиловый спирт (токсикант, преимущественно повреждающий белковые структуры биомембраны). Под микроскопом оценивали состояние парамеций по следующим критериям: индифферентность – клетки совершают равномерные броуновские движения; биоактивность – движения клеток изменены: биоцидность-50 – погибло около 50 % клеток, биоцидность-100 – гибель 100 % клеток. Для подсчёта числа инфузорий использовали гемоцитометрический способ (камера Горяева).
Самцов крыс линии Вистар массой 180–200 г содержали в стандартных условиях по 3–4 особи в клетке с контролируемыми режимами температуры (24 °C) и освещения (в течение 12 ч), со свободным доступом к воде и пище. Все животные перед экспериментом проходили карантинный период продолжительностью 21 день. При проведении эксперимента на животных были соблюдены все этические правила и нормы по отношению к ним.
Раневой процесс воспроизводили на модели линейной кожной раны, которую наносили под комбинированным наркозом – ксилазина гидрохлорид (3 мг/кг), эфир диэтиловый. Кожу спины разрезали до собственной фасции. Длина разреза составила в среднем 25 мм. Затем на равном расстоянии от краев раны накладывали 1 шов, сближающий края раны. Для удобства последующего измерения размеров ран швы накладывались с таким расчетом, чтобы эпителий боковых краев раны не соприкасался, и в этом случае эпителизация происходила от конечных краев раны. Оценку ранозаживляющего действия проводили по характеру клинического течения (наличия нагноения, времени полного отторжения струпа, времени и динамике полного срастания краев раны) на 4, 8, 12, 16, 20 дни наблюдения. В исследовании использовали фитогель оригинального состава на основе чабреца, который наносили на рану 1 раз в день ежедневно в течение 20 дней.
Материал для гистологического исследования брали на 25 сутки после нанесения линейной раны. Образцы кожи брали таким образом, чтобы в поле зрения попадал, как участок поврежденной кожи, так и соседний неповрежденный участок. Эти участки рассматривались как интактные для сравнения с поврежденными.
Полнослойный фрагмент кожи иссекали в области раны, фиксировали в 10 %-м растворе нейтрального формалина и затем заливали в парафин по стандартной методике. Срезы толщиной 5–6 мкм окрашивали гематоксилин-эозином, а также пикрофуксином по Ван Гизону для выявления коллагеновых волокон.
Результаты исследования
и их обсуждение
Результаты изучения биологической активности пяти экспериментальных фитокомпозиций в остром (продолжительность сохранения двигательной активности парамеций после добавления клеточных ядов) и хроническом (темп роста парамеций) опытах представлены в табл. 1.
Таблица 1
Экспресс-оценка биологической активности экспериментальных фитокомпозиций в остром и хроническом опытах
|
Объект |
Количество парамеций в 0,05 мл через 3 суток (при исходном 4–5 в 0,05мл) |
Размер парамеций (мкм) |
Характер движения (биологическая активность) |
Время остановки парамеций в 14 % этаноле, мин |
Время остановки парамеций в 1 %-м р-ре H2O2, мин |
|
Композиция №1 |
> 100 |
148 ± 11 |
-* |
13,3 ± 0,4 |
3,4 ± 0,1 |
|
Композиция №2 |
> 100 |
142 ± 9 |
-* |
14,1± 0,1 |
5,2 ± 0,2 |
|
Композиция №3 |
> 100 |
147 ± 9 |
-* |
15,3 ± 0,5 |
5,8 ± 0,3 |
|
Композиция №4 |
> 200 |
151 ± 16 |
-* |
17,8 ± 0,7 |
7,1 ± 0,5 |
|
Композиция №5 |
> 100 |
146 ± 11 |
-* |
15,9 ± 0,4 |
4,6 ± 0,2 |
|
Контроль |
40–50 |
145 ± 11 |
-* |
8,9 ± 0,3 |
2,4 ± 0,1 |
Примечание. * – отсутствие биологической активности, инфузории совершают хаотичные броуновские движения.
Клетки парамеций в опытных группах (культуральная среда: очищенная вода с добавлением испытуемой комбинации) по размеру и форме не отличались от клеток контрольной группы (культуральная среда: очищенная вода). Кроме того, инфузории в среде, содержащей четвертую фитокомпозицию, отличались значительно более высокой подвижностью, чем в контроле. Результаты хронического опыта свидетельствует, что экспериментальные композиции являются экологически благоприятными для выбранной биологической модели. Также установлено, что фитокомпозиции существенно и статистически значимо (р < 0,05) удлиняли период сохранения двигательной активности инфузорий от момента добавления токсиканта до их остановки.
Таким образом, предварительный скриниг на Parametium caudatum показал что, наиболее благоприятной для используемой биологической модели оказалась композиция №4, под воздействием которой заметно повышалась двигательная активность и частота деления клеток парамеций, в результате чего к третьим суткам их количество превосходило контроль в 5 раз. Кроме того, композиция № 4 оказывала максимальные мембраностабилизирующий и антиоксидантный эффекты, что проявлялось в статистически значимам удлинении времени остановки движения парамеций под воздействием спирта этилового (в 2 раза) и перекиси водорода (в 3 раза).
В дальнейшем экспериментальная композиция № 4 была использована для создания фитогеля, репаративные свойства которого были изучены на модели линейной кожной раны у крыс (табл. 2). Все животные были разделены на три группы: контрольная группа (без лечения), опытная группа (лечение фитогелем) и группа сравнения (лечение мазью
«левомеколь»).
Таблица 2
Влияние разработанного фитогеля на время заживления линейной кожной раны
|
Исследуемый объект |
Средний линейный размер раны, мм |
|||||
|
исходный |
на 4 день |
на 8 день |
на 12 день |
на 16 день |
на 20 день |
|
|
Контрольная группа (n = 7) |
26,6 ± 1,3 |
22,9 ± 0,6 |
17,8 ± 1,7 |
5,3 ± 0,5 |
3,1 ± 0,6 |
1,3 ± 0,7 |
|
Группа сравнения (n = 7) |
28,0 ± 1,0 |
22,0 ± 1,1 |
17,6 ± 1,1 |
4,3 ± 0,7 |
2,7 ± 0,5 |
0 |
|
Опытная группа (n = 7) |
25,1 ± 1,4 |
19,8 ± 1,4 |
15,2 ± 1,1 |
2,7 ± 0,5 |
1,4 ± 0,5 |
0 |
Визуальные наблюдения показали, что заживление линейной раны было более интенсивным в группе животных, подвергавшихся лечению фитогелем. Уже на 12 послеоперационные сутки происходило значительное уменьшение раневой поверхности и отечности у опытных животных, по сравнению с контрольной группой, не подвергавшейся никакому воздействию. Средний размер линейной раны в опытной группе статистически значимо (р < 0,05) был почти в 2 раза меньше, чем в контроле. В группе сравнения, как и в контроле, наблюдали уменьшение размера линейной раны, однако при данном количестве животных различия статистически незначимы (4,3мм и 5,3 мм). Как известно, 15–20 сутки соответствуют третьей фазе заживления ран – фазе формирования рубца и его эпителизации. По нашим наблюдениям, на 20 сутки в опытной группе и группе сравнения животных раны были очищены от струпа, рубец полностью эпителизирован и покрыт волосяным покровом в отличие от контроля, где и на 22 сутки еще сохранялся струп. В контрольной группе полное заживление ран наблюдалось к 24 суткам.
На 25 день были взяты образцы для гистологического исследования. Результаты гистоморфологического исследования представлены на рис. 1–4. Макроскопически к 25 дню отмечалось полное заживление ран во всех группах. Поверхности линейных ран очищены от струпа. Кожные рубцы на данный день после операции были различимы с трудом, особенно в опытной группе.
Рис. 1. Срез кожи крыс до повреждения (окраска гематоксилин-эозином,
увеличение ×400)
На рис. 2 представлена окраска среза кожи крысы контрольной группы (без лечения) по Ван Гизону. В интактной зоне коллагеновые волокна отличаются значительной толщиной и расположены рыхло. В области заживления линейной раны наблюдается формирование грануляционной ткани, в которой коллагеновые волокна заметно тоньше, достаточно плотно прилегают друг к другу, менее интенсивно окрашены. Сохраняется большое количество капиллярных сосудов, в которых содержатся эритроциты. Наличие сосудов свидетельствует о незрелости образовавшегося рубца.
(увеличение ×800), фрагмент рубца (справа)
Микроскопически к 25 дню в опытной группе имела место полная эпителизация раневой поверхности (рис. 3). В контроле (рис. 4) микроскопически видны легкая борозда и незавершенная регенерация эпителия в зоне консолидации краев раны. В контрольной группе, в отличие от опытной, под эпителием и в структуре рубца отмечались очагово-диффузные воспалительные инфильтраты.
Рис. 3. Фитогель, окраска по Ван Гизону и гематоксилин-эозином
Площадь зоны рубца и количество сосудов капиллярного типа в ней в срезах кожи животных контрольной группы (рис. 4) были значительно больше, чем у животных опытной группы (рис. 3). Отмечены различия в глубине проникновения рубцовой ткани. В опытной группе (несмотря на одинаковую глубину нанесения раны) к 25 дню рубец заканчивался на уровне волосяных фолликулов, тогда как в контроле грануляционная ткань распространялась глубоко в дерму до границы с подкожно-жировой клетчаткой.
Рис. 4. Контрольная группа (без лечения), окраска по Ван Гизону и гематоксилин-эозином
В контроле на границе рубца с неповрежденной тканью сохранялась сосудистая зона грануляционной ткани, что свидетельствует о незавершенности формирования рубца. Кроме того, на границе проникновения рубца в дерму имела место зона воспаления (васкулиты). Количество клеточных элементов преобладает над волокнистыми. В опытной группе признаков воспаления нет, отмечается запустевание сосудов, в структуре рубцовой ткани отмечается преобладание волокнистых элементов над клеточными, что говорит о завершении созревания рубца.
Число структурных образований, характерных для нормальной кожи (волосяных фолликулов и сальных желез), было заметно больше в опытной группе по сравнению с контрольной.
Выводы
1. Наиболее благоприятной в экологическом отношении для Parametium caudatum оказалась фитокомпозиция № 4, которая оказывала максимальные мембраностабилизирующий и антиоксидантный эффекты.
2. Фитогель оригинального состава на основе композиции № 4 обладает репаративными свойствами, не уступающими препарату сравнения.
3. Воздействие фитогеля приводило к изменению динамики морфологических характеристик процесса регенерации кожных ран. Согласно макроскопическим и гистологическим критериям зрелости рубца (степень эпителизации, соотношения клеточных и волокнистых элементов соединительной ткани, степень выраженности и инволюции сосудистого компонента грануляционной ткани и др.), фитогель способствует более быстрому заживлению линейной раны (регенерации кожи), формированию и созреванию рубца.
Рецензенты:
Степанова Э.Ф., д.фарм.н., профессор, профессор кафедры технологии лекарств ПятГФА, г. Пятигорск;
Шевченко А.М., д.фарм.н., профессор кафедры технологии лекарств ПятГФА,
г. Пятигорск.
Работа поступила в редакцию 25.09.2012.