Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

STUDY OF REPARATIVE PROPERTIES OF PHYTOGEL CONTAINING EXTRACTS OF THYME, GLYCYRRHIZA

Volodina T.A. 1 Penevskaya N.А. 1 Viktorov S.I. 2 Ogay M.A. 1 Majorova A.V. 3
1 Omsk State Medical Academy
2 «City Hospital № 3»
3 RUFN, Moskow
Results of studying of biological activity of phytogel of original composition are given in article. As biological objects using a cell culture experiment Parametium caudatum and white Wistar rats. For the study we constructed five compositions that were different equity ratios of each component. In tests on culture of Parametium caudatum on antioxidant and membrane stabilizing activity the optimum is chosen from five experimental compositions. Past pharmacological and hystomorphological researches with use of model of a linear skin wound on males of rats of the line Vistar showed that phytogel possesses the expressed reparation properties promoting faster healing of a linear wound, to formation and hem maturing, than in control.
reparation
phytogel
1. Alekseeva I.V. Razrabotka lekarstvennich form dlya lecheniya ran / I.V. Alekseva// Pharmaciya. 2003. no. 2. рp. 43–46.
2. Vosproizvedenie potomstva paramecii I mlecopitayushich pri raxlichnich velichinach okiskitelno-vosstanovitelnogo potenciala sredi/ E.B. Sabitova, K.M. Reznikov, A.D. Brezdinyuk// Naychnie Vedomosti BelGU. 2012. no. 4(123). 17/1. рр. 219–222.
3. Issledovaniya po razrabotke sostava mazi dlya lecheniya ranevogo processa/ T.E. Ryumina, I.V.Alekseeva V.I. Pancurkin, L.N. Shmakova// Sankt-Peterburgskii nauchnii forum. 2003: materiali III Megdunar. naych.-prakt. conf. molodich uchenich. Р-Pb, 2003. T.2. pp. 46–47.
4. Kudrin, A.N. Sistema express-metodov integralnoi ocenki biologicheskoi activnosti individualnich I kompleksnich preperatov na biologicheskich objektach/ A.N. Kudrin, V.V. Ananin, V.U. Balabyan // Ros. Chim. Jurn. 1997. T.41. no. 5. pp. 114–123.
5. Opit primeneniya novogo preparata pri lechenii ranevogo processa/ S.C. Kichemasov, E.K. Gumanenko, V.V. Vorobjov, I.V. Alekseeva I dr. // Novie technologii v diagnostike I lechenii chirurgicheskoi infekcii na osnove dokazatelnoi medicine: materiali VI Vseros. Conf. s megdunar. Uchastiem «Rani I ranevaya infekciya». Moskow, 2003. pp. 55–57.

Несмотря на обилие имеющихся на фармацевтическом рынке лекарственных средств для местного лечения раневых и воспалительных процессов, приходится констатировать, что желаемая степень терапевтического эффекта до сих пор не достигнута [1, 4, 5]. В последнее десятилетие отмечается возрастающий интерес к средствам растительного происхождения, что объясняется наличием широкого спектра фармакологического действия, мягко и гармонично воздействующего на все системы организма при минимальном количестве побочных эффектов в условиях длительного применения, а также экономичностью.

Рациональное лечение ран – одна из наиболее острых и сложных проблем современной медицинской практики. На сегодняшний день ни один из методов лечения ран с использованием лекарственных средств не является универсальным, надежным, в полной мере удовлетворяющим клиницистов. Этиология и патогенез раневого процесса делают необходимым дифференцировать подход к созданию лекарственных форм для местного лечения раневой патологии [3,5].

Цель: изучить биологическую активность фитогеля оригинального состава.

Материалы и методы исследования

На первом этапе исследования были сконструированы 5 композиций из густых экстрактов чабреца, каштана, солодки, крапивы, масляного экстракта зверобоя и дигидрокверцетина. Композиции отличались долевыми соотношениями каждого из компонентов.

В качестве биологических объектов использовали культуру клеток Parametium caudatum и белых крыс линии Вистар. Parametium caudatum легко культивировать и при исследовании ее роста и размножения возможно быстро получить большой объем цифровой информации [2, 4]. Для культивирования парамеций использовали среду Лозина-Лозинского при рН водной среды 6,2–7,8 и температурном оптимуме 20–26 °С. Пищей для парамеций служили живые дрожжи – Rhadotorula gracilis с добавлением пшеничной муки. Для определения чувствительности парамеций на предметное стекло наносили две капли среды (число парамеций в каждой капле не менее 5 особей), одна капля служила контролем, ко второй тангенциально наносили каплю соответствующего объема 0,9 % раствора натрия хлорида. При этом парамеции считаются чувствительными в случае ускорения движения не более 4 особей из 5 по результатам 5 измерений. Двигательная активность парамеций во многом формируется на основе работы ионных каналов, встроенных в мембрану ресничек, и является характеристикой, отражающей функциональное состояние клетки [2]. При этом Parametium caudatum функционирует в направлении сохранения мембранного потенциала. В результате снижения мембранного потенциала клетки двигаются медленнее или вращаются на месте вокруг одного конца. Для оценки чувствительности по параметру – замедление движений – использовали 0,5 %-й раствор калия хлорида и проводили опыты по аналогичной методике. При этом парамеции считаются чувствительными в случае замедления движения не менее 4 особей из 5 по сравнению с контролем. Для изучения протективного (антиоксидантного и мембраностабилизирующего) действия исследуемых композиций оценивали их влияние на продолжительность периода активности инфузорий в среде с добавлением токсических веществ: 1 %-й раствор водорода пероксида (токсикант, который in vivo расщепляется до перекисных радикалов и повреждает преимущественно липидную часть мембраны) и 14 %-й этиловый спирт (токсикант, преимущественно повреждающий белковые структуры биомембраны). Под микроскопом оценивали состояние парамеций по следующим критериям: индифферентность – клетки совершают равномерные броуновские движения; биоактивность – движения клеток изменены: биоцидность-50 – погибло около 50 % клеток, биоцидность-100 – гибель 100 % клеток. Для подсчёта числа инфузорий использовали гемоцитометрический способ (камера Горяева).

Самцов крыс линии Вистар массой 180–200 г содержали в стандартных условиях по 3–4 особи в клетке с контролируемыми режимами температуры (24 °C) и освещения (в течение 12 ч), со свободным доступом к воде и пище. Все животные перед экспериментом проходили карантинный период продолжительностью 21 день. При проведении эксперимента на животных были соблюдены все этические правила и нормы по отношению к ним.

Раневой процесс воспроизводили на модели линейной кожной раны, которую наносили под комбинированным наркозом – ксилазина гидрохлорид (3 мг/кг), эфир диэтиловый. Кожу спины разрезали до собственной фасции. Длина разреза составила в среднем 25 мм. Затем на равном расстоянии от краев раны накладывали 1 шов, сближающий края раны. Для удобства последующего измерения размеров ран швы накладывались с таким расчетом, чтобы эпителий боковых краев раны не соприкасался, и в этом случае эпителизация происходила от конечных краев раны. Оценку ранозаживляющего действия проводили по характеру клинического течения (наличия нагноения, времени полного отторжения струпа, времени и динамике полного срастания краев раны) на 4, 8, 12, 16, 20 дни наблюдения. В исследовании использовали фитогель оригинального состава на основе чабреца, который наносили на рану 1 раз в день ежедневно в течение 20 дней.

Материал для гистологического исследования брали на 25 сутки после нанесения линейной раны. Образцы кожи брали таким образом, чтобы в поле зрения попадал, как участок поврежденной кожи, так и соседний неповрежденный участок. Эти участки рассматривались как интактные для сравнения с поврежденными.

Полнослойный фрагмент кожи иссекали в области раны, фиксировали в 10 %-м растворе нейтрального формалина и затем заливали в парафин по стандартной методике. Срезы толщиной 5–6 мкм окрашивали гематоксилин-эозином, а также пикрофуксином по Ван Гизону для выявления коллагеновых волокон.

Результаты исследования
и их обсуждение

Результаты изучения биологической активности пяти экспериментальных фитокомпозиций в остром (продолжительность сохранения двигательной активности парамеций после добавления клеточных ядов) и хроническом (темп роста парамеций) опытах представлены в табл. 1.

Таблица 1

Экспресс-оценка биологической активности экспериментальных фитокомпозиций в остром и хроническом опытах

Объект
исследования

Количество парамеций в 0,05 мл через 3 суток (при исходном 4–5 в 0,05мл)

Размер парамеций (мкм)

Характер движения (биологическая активность)

Время остановки парамеций в 14 % этаноле, мин

Время остановки парамеций в 1 %-м р-ре H2O2, мин

Композиция №1

 > 100

148 ± 11

-*

13,3 ± 0,4

3,4 ± 0,1

Композиция №2

 > 100

142 ± 9

-*

14,1± 0,1

5,2 ± 0,2

Композиция №3

 > 100

147 ± 9

-*

15,3 ± 0,5

5,8 ± 0,3

Композиция №4

 > 200

151 ± 16

-*

17,8 ± 0,7

7,1 ± 0,5

Композиция №5

 > 100

146 ± 11

-*

15,9 ± 0,4

4,6 ± 0,2

Контроль

40–50

145 ± 11

-*

8,9 ± 0,3

2,4 ± 0,1

Примечание. * – отсутствие биологической активности, инфузории совершают хаотичные броуновские движения.

Клетки парамеций в опытных группах (культуральная среда: очищенная вода с добавлением испытуемой комбинации) по размеру и форме не отличались от клеток контрольной группы (культуральная среда: очищенная вода). Кроме того, инфузории в среде, содержащей четвертую фитокомпозицию, отличались значительно более высокой подвижностью, чем в контроле. Результаты хронического опыта свидетельствует, что экспериментальные композиции являются экологически благоприятными для выбранной биологической модели. Также установлено, что фитокомпозиции существенно и статистически значимо (р < 0,05) удлиняли период сохранения двигательной активности инфузорий от момента добавления токсиканта до их остановки.

Таким образом, предварительный скриниг на Parametium caudatum показал что, наиболее благоприятной для используемой биологической модели оказалась композиция №4, под воздействием которой заметно повышалась двигательная активность и частота деления клеток парамеций, в результате чего к третьим суткам их количество превосходило контроль в 5 раз. Кроме того, композиция № 4 оказывала максимальные мембраностабилизирующий и антиоксидантный эффекты, что проявлялось в статистически значимам удлинении времени остановки движения парамеций под воздействием спирта этилового (в 2 раза) и перекиси водорода (в 3 раза).

В дальнейшем экспериментальная композиция № 4 была использована для создания фитогеля, репаративные свойства которого были изучены на модели линейной кожной раны у крыс (табл. 2). Все животные были разделены на три группы: контрольная группа (без лечения), опытная группа (лечение фитогелем) и группа сравнения (лечение мазью
«левомеколь»).

Таблица 2

Влияние разработанного фитогеля на время заживления линейной кожной раны

Исследуемый объект

Средний линейный размер раны, мм

исходный

на 4 день

на 8 день

на 12 день

на 16 день

на 20 день

Контрольная группа

(n = 7)

26,6 ± 1,3

22,9 ± 0,6

17,8 ± 1,7

5,3 ± 0,5

3,1 ± 0,6

1,3 ± 0,7

Группа сравнения (n = 7)

28,0 ± 1,0

22,0 ± 1,1

17,6 ± 1,1

4,3 ± 0,7

2,7 ± 0,5

0

Опытная группа (n = 7)

25,1 ± 1,4

19,8 ± 1,4

15,2 ± 1,1

2,7 ± 0,5

1,4 ± 0,5

0

Визуальные наблюдения показали, что заживление линейной раны было более интенсивным в группе животных, подвергавшихся лечению фитогелем. Уже на 12 послеоперационные сутки происходило значительное уменьшение раневой поверхности и отечности у опытных животных, по сравнению с контрольной группой, не подвергавшейся никакому воздействию. Средний размер линейной раны в опытной группе статистически значимо (р < 0,05) был почти в 2 раза меньше, чем в контроле. В группе сравнения, как и в контроле, наблюдали уменьшение размера линейной раны, однако при данном количестве животных различия статистически незначимы (4,3мм и 5,3 мм). Как известно, 15–20 сутки соответствуют третьей фазе заживления ран – фазе формирования рубца и его эпителизации. По нашим наблюдениям, на 20 сутки в опытной группе и группе сравнения животных раны были очищены от струпа, рубец полностью эпителизирован и покрыт волосяным покровом в отличие от контроля, где и на 22 сутки еще сохранялся струп. В контрольной группе полное заживление ран наблюдалось к 24 суткам.

На 25 день были взяты образцы для гистологического исследования. Результаты гистоморфологического исследования представлены на рис. 1–4. Макроскопически к 25 дню отмечалось полное заживление ран во всех группах. Поверхности линейных ран очищены от струпа. Кожные рубцы на данный день после операции были различимы с трудом, особенно в опытной группе.

рис_38.tif

Рис. 1. Срез кожи крыс до повреждения (окраска гематоксилин-эозином,
увеличение ×400)

На рис. 2 представлена окраска среза кожи крысы контрольной группы (без лечения) по Ван Гизону. В интактной зоне коллагеновые волокна отличаются значительной толщиной и расположены рыхло. В области заживления линейной раны наблюдается формирование грануляционной ткани, в которой коллагеновые волокна заметно тоньше, достаточно плотно прилегают друг к другу, менее интенсивно окрашены. Сохраняется большое количество капиллярных сосудов, в которых содержатся эритроциты. Наличие сосудов свидетельствует о незрелости образовавшегося рубца.

рис_39.tif

Рис. 2. Срез кожи крысы контрольной группы (без лечения), окраска по Ван Гизону
(увеличение ×800), фрагмент рубца (справа)

Микроскопически к 25 дню в опытной группе имела место полная эпителизация раневой поверхности (рис. 3). В контроле (рис. 4) микроскопически видны легкая борозда и незавершенная регенерация эпителия в зоне консолидации краев раны. В контрольной группе, в отличие от опытной, под эпителием и в структуре рубца отмечались очагово-диффузные воспалительные инфильтраты.

рис_40.tif рис_41.tif

Рис. 3. Фитогель, окраска по Ван Гизону и гематоксилин-эозином

Площадь зоны рубца и количество сосудов капиллярного типа в ней в срезах кожи животных контрольной группы (рис. 4) были значительно больше, чем у животных опытной группы (рис. 3). Отмечены различия в глубине проникновения рубцовой ткани. В опытной группе (несмотря на одинаковую глубину нанесения раны) к 25 дню рубец заканчивался на уровне волосяных фолликулов, тогда как в контроле грануляционная ткань распространялась глубоко в дерму до границы с подкожно-жировой клетчаткой.

рис_42.tif рис_43.tif

Рис. 4. Контрольная группа (без лечения), окраска по Ван Гизону и гематоксилин-эозином

В контроле на границе рубца с неповрежденной тканью сохранялась сосудистая зона грануляционной ткани, что свидетельствует о незавершенности формирования рубца. Кроме того, на границе проникновения рубца в дерму имела место зона воспаления (васкулиты). Количество клеточных элементов преобладает над волокнистыми. В опытной группе признаков воспаления нет, отмечается запустевание сосудов, в структуре рубцовой ткани отмечается преобладание волокнистых элементов над клеточными, что говорит о завершении созревания рубца.

Число структурных образований, характерных для нормальной кожи (волосяных фолликулов и сальных желез), было заметно больше в опытной группе по сравнению с контрольной.

Выводы

1. Наиболее благоприятной в экологическом отношении для Parametium caudatum оказалась фитокомпозиция № 4, которая оказывала максимальные мембраностабилизирующий и антиоксидантный эффекты.

2. Фитогель оригинального состава на основе композиции № 4 обладает репаративными свойствами, не уступающими препарату сравнения.

3. Воздействие фитогеля приводило к изменению динамики морфологических характеристик процесса регенерации кожных ран. Согласно макроскопическим и гистологическим критериям зрелости рубца (степень эпителизации, соотношения клеточных и волокнистых элементов соединительной ткани, степень выраженности и инволюции сосудистого компонента грануляционной ткани и др.), фитогель способствует более быстрому заживлению линейной раны (регенерации кожи), формированию и созреванию рубца.

Рецензенты:

Степанова Э.Ф., д.фарм.н., профессор, профессор кафедры технологии лекарств ПятГФА, г. Пятигорск;

Шевченко А.М., д.фарм.н., профессор кафедры технологии лекарств ПятГФА,
г. Пятигорск.

Работа поступила в редакцию 25.09.2012.