Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

POLYMORPHISM OF CSN3, bGH AND bPRL GENES IN CONNECTION WITH MILK QUALITY TRAITS IN KOSTROMA CATTLE BREED

Perchun A.V. 1 Lazebnaya I.V. 1 Belokurov S.G. 1 Ruzina M.N. 2 Sulimova G.E. 2
1 Kostroma State Agricultural Academy
2 Vavilov Institute of General Genetics Russian Academy of Sciences
Polymorphysms of the kappa-casein (CSN3), prolactin (bPRL-RsaI) and growth hormone (bGH-AluI) genes in Kostroma cattle breed from the Karavaevo farm of the Kostroma region were revealed. Distributions of the most frequent alleles and genotypes of the genes studied were the following: allele B (0,624) and genotype AB (0,528) of the CSN3 gene, allele A (0,720) and genotypes AA (0,496) and AB (0,448) of the bPRL gene, and allele L (0,940) and genotype LL (0,880) of the bGH gene. The observed (Hobs) and expected (Hexp) heterozygosities for all genes studied did not differ significantly from each other. Study of the effects of the genes on milk production traits for 305 days of the first lactation revealed the following: significantly better in milk yield and milk protein were animals of the LL genotype of the bGH gene, 6456 kg and 208,5 kg, correspondingly, in fat content – animals of the VL genotype (4,38 %). The most preferred genotype in fat content of the CSN3 gene was BB genotype exceeded AA genotype (more on 3,25 %). Significant differences for the bPRL gene were not found.
kostroma cattle breed
milk production
DNA-polymorphism
kappa-casein gene
prolactin gene
growth hormone gene
1. Balackij V.N. Sel’skohozjajstvennaja biologija, 1998, no. 4, pp. 43–53.
2. Hatami S.R., Lazebnyj O.E., Maksimenko V.F., Sulimova G.E. Genetika, 2005, vol. 41, no. 2, pp. 229–236.
3. Dolmatova I.Ju., Gareeva I.T., Il’jasov A.G. Dostizhenija nauki i tehniki APK, 2010, no. 2, pp. 42–43.
4. Sibagatullin F.S., Faizov T.H., Sharafutdinov G.S., Validov Sh.Z., Shajdullin R.R. Vestnik Kazanskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta, 2010, vol. 15, no. 1, pp. 130–132.
5. Kalashnikova L.A., Trufanov V.G. Doklady Rossijskoj akademii sel’skohozjajstvennyh nauk, 2006, no. 4, pp. 43–44.
6. Lazebnaja I.V., Lazebnyj O.E., Ruzina M.N., Badin G.A., Sulimova G.E. Sel’skohozjajstvennaja biologija, 2011, no. 4, pp. 46–51.
7. Zinov’eva N.A., Kostjunina O.V., Gladyr’ E.A., Bannikova A.D., Harzinova V.R., Larionova P.V., Shavyrina K.M., Jernst L.K. Zootehnija, 2010, no. 1, pp. 8–10.
8. Sulimova G.E., Lazebnaja I.V., Perchun A.V., Ruzina M.N., Badin G.A. Dostizhenija nauki i tehniki APK, 2011, no. 9, pp. 52–54.
9. Dybus A., Grzesiak W., Kamieniecki H., Szatkowska I., Sobek Z., Blaszczyk P., Czerniawska-Piatkowska E., Zych S., Muszynska M. Arch. Tierz., Dummerstorf, 2005, vol. 48, no. 2, pp. 149–156.
10. Dybus A. Arch. Tierz., Dummerstorf, 2002, vol. 45, no. 5, pp. 421–428.
11. Bonfatti V, Cecchinato A, Di Martino G, De Marchi M, Gallo L, Carnier P. J. Dairy Sci., 2001, vol. 94, no. 2, pp. 602–613.
12. Sabour M.P., Lin C.Y., Smith C. Journal of Animal Breeding and Genetics, 1997, vol. 114, pp. 435–442.

Полиморфизм генов, ассоциированных с параметрами молочной продуктивности, позволяет вести селекцию домашних животных с учетом ценных генотипов в отношении хозяйственно полезных признаков. Установленный для крупного рогатого скота (КРС) спектр генов-кандидатов на связь с признаками молочной продуктивности включает в себя гены основных белков молока (лактальбуминов и казеинов), гены гормонов, стимулирующих их экспрессию, а также гены, продукты которых регулируют обмен протеинов и липидов в организме [7]. Среди них особое место занимают гены каппа-казеина, гормона роста и пролактина [1, 4, 9].

Каппа-казеин обеспечивает оптимальные технологические свойства молока при производстве сыра, поэтому его ген рассматривают в качестве одного из основных маркеров племенной ценности КРС [4]. Ген каппа-казеина (CSN3) у представителей вида Bos taurus L. находится на 6-й хромосоме. Из десяти описанных аллелей этого гена наиболее часто встречаются аллельные варианты A и B, которые отличаются двумя аминокислотными заменами
в 136-м Thr(A)/Ile(B) и 148-м Asp(A)/Ala(B) положениях полипептидной цепи. Многими зарубежными [11] и отечественными [5] исследователями установлена ассоциация B-аллеля гена CSN3 с более высоким содержанием белка в молоке и выходом сыра, а также с лучшими коагуляционными свойствами молока у КРС.

Гормон роста (bGH) – важнейший регулятор соматического роста животных, обладающий, в том числе лактогенным и жиромобилизующим действием. У КРС ген гормона роста локализован на 19-й хромосоме и состоит из пяти экзонов и четырёх интронов. AluI рестрикционный полиморфизм в пятом экзоне гена связан с трансверсией C-G, приводящей к замене в белковом продукте гена аминокислоты лейцин на аминокислоту валин (Leu на Val, 127 позиция). Рядом учёных [1, 2, 10] установлена связь различных полиморфных вариантов гена bGH с такими хозяйственно-полезными признаками КРС как рост и развитие, молочная продуктивность (удой, содержание жира и белка в молоке).

Пролактин (bPRL) – один из самых универсальных гормонов гипофиза с точки зрения его биологической активности. Он участвует в дифференцировке эпителиальных клеток молочной железы, инициации и поддержании лактации, регуляции синтеза молочных белков и жиров. Таким образом, ген пролактина является потенциальным генетическим маркером признаков молочной продуктивности в животноводстве. У КРС ген bPRL расположен на 23-й хромосоме и состоит, как и ген bGH, из пяти экзонов и четырёх интронов. Установлено, что синонимичная A-G замена, возникающая в кодоне для 103 аминокислоты, приводит к появлению полиморфного RsaI-сайта. Во многих исследованиях [2, 3, 9] показана связь RsaI-генотипов гена bPRL у КРС с параметрами молочной продуктивности.

Костромская порода КРС является одной из лучших отечественных пород мясо-молочного направления продуктивности. Исследованию ее генофонда по перечисленным молекулярным маркерам посвящены работы ряда авторов [6, 8], однако животные из хозяйства ОАО ПЗ «Караваево», являющегося родоначальником костромской породы, не были изучены.

Цель нашего исследования заключалась в изучении полиморфизма генов каппа-казеина, гормона роста и пролактина у коров костромской породы в связи с параметрами молочной продуктивности.

Материал и методы исследования

Исследования проведены в лаборатории сравнительной генетики животных ИОГен РАН. Материалом для исследований послужила кровь коров костромской породы (n = 125) из хозяйства ОАО ПЗ «Караваево» Костромской области. Кровь для выделения ДНК отбирали из ярёмной вены в объёме 5 мл в вакуумные пробирки с сухим ЭДТА К3 (ООО «ГЕМ», Россия). Геномную ДНК животных выделяли из 200 мкл цельной крови с использованием набора реагентов «DIAtomTMDNA Prep» (IsoGene Lab., Москва) согласно прописи, предоставленной изготовителем.

Тестирование А- и В-аллелей гена CSN3 проводили с помощью метода аллель-специфичной полимеразной реакции с использованием набора «GenePak k-Casein A/B PCR test» (IsoGene Lab., Москва) согласно прописи изготовителя. Амплификацию проводили в термоциклере «DNA Engine Dyad» (BioRad, США) в следующем режиме: первый цикл – 95 °С, 2 мин; последующие 32 цикла – 95 °С, 15 с; 62 °С, 40 с; 72 °С, 30 с; заключительный цикл – 72 °С, 7 мин.

Полиморфизм генов bGH и bPRL исследовали методом PCR-RFLP. Для амплификации фрагментов этих генов использовали следующие пары олигонуклеотидных праймеров, синтезированных в ООО НПФ «Литех» (г. Москва): GH-F: 5’-GCTGCTCCTGAGGGCCCTTCG-3’ и GH-R: 5’-GCGGCGGCACTTCATGACCCT-3’ (для гена bGH); PR3-F: 5’-CGAGTCCTTATGAGCTTGATTCTT-3’ и PR3-R: 5’- GCCTTCCAGAAGTCGTTTGTTTTC-3’ (для гена bPRL) [3]. Амплификацию проводили с применением набора «GenePakTM PCR Core» (IsoGene Lab., Москва) в термоциклере «Терцик» (ООО «ДНК-технология», Россия) в следующем режиме: для фрагмента гена bGH: первый цикл – 94 °С, 4 мин; последующие 35 циклов – 94 °С, 45 с; 65 °С, 45 с; 72 °С, 45 с; заключительный цикл – 72 °С, 7 мин.; для фрагмента гена bPRL: первый цикл – 95 °С, 5 мин; последующие 35 циклов – 95 °С, 30 с; 57 °С, 30 с; 72 °С, 30 с; заключительный цикл – 72 °С, 7 мин. Полученные продукты амплификации генов bPRL и bGH обрабатывали эндонуклеазами рестрикции RsaI и AluI соответственно в течение 20 часов при соблюдении условий, указанных фирмой-производителем (MBI Fermentas, Литва).

Размер продуктов рестрикции фрагмента гена bGH оценивали методом электрофореза в 2 %-м агарозном геле, а фрагмента гена bPRL – в 6 %-м полиакриламидном геле (1х TBE, бромистый этидий 0,5 мкг/мл, 100V). Результаты электрофореза регистрировали в ультрафиолете с использованием системы гельдокументации «UVT-1» (Biokom, Россия).

Удой, содержание жира и белка (кг, %) в молоке оценивали за 305 дней первой лактации по данным зоотехнического учёта (форма 2-мол). Статистическую обработку результатов проводили в программе «Microsoft Excel 2010». Достоверность попарных различий между средними значениями признаков оценивали с использованием критерия Стьюдента.

Результаты исследования
и их обсуждение

Проведённое исследование выявило полиморфизм всех рассматриваемых генов (табл. 1). В изученной выборке коров наблюдается значительное преобладание животных с генотипом AB (0,528) гена CSN3. Генотип AA, менее желательный при производстве молока, согласно работам [5, 11], был выявлен у 14 коров (0,112). Частота аллеля А составила 0,376, аллеля B – 0,624. В отношении гена bPRL было установлено, что частота аллеля А преобладает над частотой аллеля B более чем в два раза и составляет 0,72. Генотипы AA и AB гена пролактина у исследованных животных встречались примерно с одинаковой частотой – 0,496 и 0,448, соответственно. Частота генотипа BB у коров находилась на низком уровне и составила всего 0,056. Что касается гена bGH, то частота генотипа LL значительно превосходила частоту генотипа VL, и составила 0,88. Животных же c генотипом VV в данной выборке выявлено не было, что согласуется с ранее проведённым исследованием костромской породы [6].

Таблица 1

Частота генотипов и аллелей генов CSN3, bPRL и bGH
у коров костромской породы (n = 125)

Ген

Число
животных, гол.

Генотип

Частота генотипов ± s.e.

Аллель

Частота аллелей ± s.e.

Hexp

c2

CSN3

14

66

45

AA

AB (Hobs)

BB

0,112 ± 0,028

0,528 ± 0,045

0,360 ± 0,043

A

B

0,376 ± 0,043

0,624 ± 0,043

0,469± 0,045

2,03

bPRL

62

56

7

AA

AB

BB

0,496 ± 0,045

0,448 ± 0,044

0,056 ± 0,021

A

B

0,720 ± 0,040

0,280 ± 0,040

0,403 ± 0,044

1,22

bGH

15

110

VL

LL

0,120 ± 0,029

0,880 ± 0,029

V

L

0,060 ± 0,021

0,940 ± 0,021

0,110 ± 0,028

0,10

Примечания: s.e. – стандартная ошибка; Hobs – наблюдаемая гетерозиготность; Hexp – ожидаемая гетерозиготность; c2 – критерий соответствия.

Не установлено статистически значимого отклонения эмпирического распределения частот генотипов от распределения генотипов по Харди-Вайнбергу ни по одному из генов, так же, как не установлено достоверных различий между значениями наблюдаемой (Hobs) и ожидаемой (Hexp) гетерозиготности (табл. 1).

В табл. 2 показана связь генотипов по локусам рассматриваемых генов с показателями молочной продуктивности коров за 305 дней 1-й лактации.

Таблица 2

Молочная продуктивность коров костромской породы с различными генотипами
(за 305 дней первой лактации)

Генотип

Удой, кг

Жир, %

Количество молочного жира, кг

Белок, %

Количество молочного белка, кг

Ген CSN3

AA

6351 ± 321

4,25 ± 0,08

277,4 ± 16,5

3,18 ± 0,02*

201,9 ± 10,2

AB

6364 ± 133

4,15 ± 0,04

264,1 ± 5,8

3,23 ± 0,01

205,5 ± 4,3

BB

6494± 164

4,15 ± 0,04

269,0 ± 7,1

3,25 ± 0,01*

210,6 ± 5,2

Ген bPRL

AA

6416 ± 142

4,14 ± 0,04

265,3 ± 5,7

3,23 ± 0,01

207,4 ± 4,5

AB

6426 ± 144

4,19 ± 0,04

270,6 ± 7,1

3,23 ± 0,01

207,2 ± 4,6

BB

6207 ± 435

4,17 ± 0,08

259,2 ± 20,8

3,23 ± 0,04

200,5 ± 14,8

Ген bGH

LL

6456 ±108*

4,13 ± 0,03**

267,3 ± 4,8

3,23 ± 0,01

208,5 ± 3,5*

VL

6064 ± 156*

4,38 ± 0,07**

268,1 ± 7,2

3,22 ± 0,01

195,1 ± 4,9*

Примечания: * – P < 0,05 и ** – P < 0,01 (критерий Стьюдента).

Из таблицы видно, что по процентному содержанию белка животные с генотипом BB гена CSN3 имели преимущество над животными с генотипом AA. За 305 дней лактации они продуцировали в среднем на 0,07 % (P < 0,05) больше белка. При рассмотрении молочной продуктивности животных с различными генотипами гена bPRL достоверных различий установлено не было. По исследованному SNP гена bGH было выявлено, что наибольшими показателями удоя (6456 кг) и количества молочного белка (208,5 кг) характеризовались животные с генотипом LL, что на 6,1 и 6,9 % больше, соответственно, чем у их сверстниц с генотипом VL. При этом коровы с генотипом VL продуцировали молоко с большим процентным содержанием жира, равным 4,38 % (на 0,25 % больше, P < 0,01).

При анализе совместного влияния рассматриваемых генов на показатели молочной продуктивности коров костромской породы в первой лактации из 15 выявленных комплексных генотипов нами было учтено восемь, частота которых превышала 2,4 %. Наиболее часто встречались животные с генотипами AB/AA/LL (25,8 %),
AB/AB/LL (20,0 %) и BB/AA/LL (16,8 %) (табл. 3).

Таблица 3

Молочная продуктивность коров костромской породы с различными комплексными генотипами за первую лактацию

Генотип гена

n

Удой, кг

Жир, %

Количество молочного жира, кг

Белок, %

Количество молочного белка, кг

CSN3

bPRL

bGH

AA

AB

LL

9

6429 ± 496

4,26 ± 0,12

280,6 ± 26,0

3,18 ± 0,03

204,4 ± 15,8

AB

AA

LL

32

6339 ± 186

4,11 ± 0,04a*

260,3 ± 7,7

3,24 ± 0,02

205,3 ± 6,1

AB

AA

LV

5

6085 ± 264

4,42 ± 0,21a*b*

269,0 ± 16,1

3,19 ± 0,02

194,1 ± 7,5

AB

AB

LL

25

6531 ± 250

4,13 ± 0,06

269,8 ± 11,3

3,22 ± 0,02

210,3 ± 7,9

BB

AA

LL

21

6736 ± 291

4,04 ± 0,05b*

271,8 ± 11,5

3,24 ± 0,01

217,9 ± 9,2

BB

AB

LL

15

6373 ± 232

4,21 ± 0,08

269,3 ± 12,9

3,26 ± 0,04

207,5 ± 7,3

BB

AB

LV

3

5790 ± 327

4,27 ± 0,06

246,9 ± 10,7

3,23 ± 0,02

186,7 ± 9,7

BB

BB

LL

4

6469 ± 564

4,15 ± 0,15

269,6 ± 30,3

3,24 ± 0,06

210,2 ± 21,7

Примечание: буквенными индексами (a, b) обозначены пары достоверно различающихся генотипов при уровне достоверности: * – P < 0,05 (критерий Стьюдента).

Проведённый анализ показал достоверное превосходство коров с генотипом AB/AA/LV по процентному содержанию жира в молоке над животными с генотипами AB/AA/LL и BB/AA/LL на 0,31 % (P < 0,05) и 0,38 % (P < 0,05) соответственно. Наблюдаемые между животными с генотипами AA/AB/LL и BB/AA/LL различия по процентному содержанию белка носят характер тенденции (P = 0,054). По другим генотипам достоверных различий в показателях молочной продуктивности за 305 дней первой лактации найдено не было.

Заключение

Итак, проведённое исследование свидетельствует о связи показателей молочной продуктивности у исследованных коров костромской породы из ОАО ПЗ «Караваево» с генотипами генов CSN3 и bGH. Полученные данные по ассоциации LL генотипа гена bGH с высокими показателями удоя и количества молочного белка за 305 дней первой лактации согласуются с закономерностями, описанными у коров черно-пестрой породы [10]. Выявленное преимущество костромских коров с VL генотипом этого же гена по содержанию молочного жира наблюдалось также у коров голштинской породы [12]. Отметим, что ранее достоверных связей показателей молочной продуктивности с геном bGH у костромского скота обнаружено не было, однако, была отмечена тенденция связи генотипа VL гена гормона роста (bGH) с более высоким содержанием жира по сравнению с генотипом
LL (P = 0,086) [6]. Наибольшим процентным содержанием белка в молоке характеризовались животные с генотипом BB гена CSN3, что не противоречит данным других авторов [5, 11]. В настоящем исследовании установлено, что коровы с комплексным генотипом AB/AA/VL (гены
CSN3/bPRL/bGH) продуцируют молоко со значимо более высоким содержанием молочного жира по сравнению с коровами генотипов AB/AA/LL и BB/AA/LL. Нами не было установлено влияния RsaI-полиморфизма гена bPRL на исследованные признаки, как и в работе [6].

Таким образом, при разведении и совершенствовании животных костромской породы КРС с целью повышения уровня и качества получаемого от них молока хозяйствам как племенных, так и товарных стад, целесообразно рассматривать полученные результаты как дополнительный критерий при ведении селекционно-племенной работы с использованием ДНК-маркеров при отборе и подборе животных. Однако следует отметить, что для массового применения установленных закономерностей на практике необходима проверка их универсальности на больших выборках животных.

Работа выполнена при поддержке программы ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы (Шифр лота: 2012-1.4-12-000-1001, шифр заявки: 2012-1.4-12-000-1001-007, Номер соглашения: 8088) и РФФИ (проект № 12-04-90880-мол_рф_нр).

Рецензенты:

Кокшарова О.А., д.б.н., в.н.с. Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, г. Москва;

Куликов А.М., д.б.н., с.н.с., ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Коль-
цова РАН», г. Москва.

Работа поступила в редакцию 16.10.2012.