Микроядерный тест с успехом используется при проведении клинических исследований. Регистрация структурно-функциональных изменений, при которых в клетках выявляется наличие микроядер, представляет собой высокоинформативный и вместе с тем простой в техническом отношении метод оценки влияния на организм различного рода факторов [7]. Некоторые исследователи рекомендуют применение метода учета клеток с микроядрами для массового скрининга лиц, предрасположенных к нестабильности генома, с целью их последующей диспансеризации [8].
В настоящий момент широко распространен микроядерный тест в эпителиоцитах слизистой оболочки ротовой полости человека в связи с отсутствием необходимости в специальном лабораторном оборудовании, сравнительной простотой, быстротой и дешевизной этого анализа. Следует также отметить, что буккальный эпителий является своеобразным «зеркалом», отражающим состояние всего организма в целом [3]. Поэтому результаты микроядерного теста в клетках данного типа могут служить показателем действия на организм эндо- и экзогенных факторов, вызывающих численные и структурные аберрации хромосом и приводящие к образованию микроядер [19, 20]. Повышенный уровень микроядер в клетках слизистого эпителия полости рта может служить своеобразным сигналом различных патологических состояний организма (аллергозы, паразитарные инвазии, некоторые генетические болезни), косвенно указывая на нарушения в работе иммунной системы организма [18].
Выполнены работы по определению частоты буккальных клеток с микроядрами у пациентов с пигментной ксеродермой [29], у опухолевых больных [10], у больных оральной и фарингиальной карциномой, алкоголиков [28], у детей, страдающих хроническим тонзиллитом [30], и больных гастродуоденитом [15], при различных инфекционных заболеваниях (брюшной тиф, дизентерия и др.) [8], у больных клещевым энцефалитом [9], у больных шизофренией с непрерывным типом течения [12], при пародонтите [12], у больных системной красной волчанкой [26], при аллергических состояниях [1], у часто болеющих (более 4 раз в год) острыми респираторными заболеваниями детей [27]. Однако не изучено влияние патологических состояний, обусловленных сахарным диабетом I типа, на уровень клеток с цитологическими нарушениями у подростков.
Сахарный диабет занимает третье место по распространенности в мире после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний и представляет важнейшую проблему для современной медицины вследствие частой встречаемости, высокой ранней инвалидизации, смертности по причине развития поздних сосудистых осложнений, значительных экономических затрат общества на лечение. Эпидемиологические исследования в разных странах свидетельствуют об увеличении количества случаев возникновения сахарного диабета I типа у детей и подростков. Именно в этом возрасте данная болезнь представляет собой тяжелое страдание, которое меняет весь жизненный уклад семьи, требует пристального внимания, больших физических и эмоциональных усилий, экономических затрат со стороны ребенка и родителей, работников органов здравоохранения и общества в целом [6].
При сахарном диабете I типа в крови больных уменьшается количество общего белка, повышается концентрация креатинина и мочевины, уровень холестерина и триглицеридов превышает нормы [25], отмечается снижение общего состояния здоровья, ролевого физического, социального и эмоционального функционирования [4], что может отразиться на стабильности генома больных.
В связи с вышесказанным целью работы стало установление стабильности генетического аппарата организма подростков, больных сахарным диабетом I типа, с использованием микроядерного теста в буккальном эпителии ротовой полости.
Материал и методы исследования
Было обследовано 24 подростка (9 девушек и 15 юношей) в возрасте 12–14 лет, больных сахарным диабетом I типа, находящихся на стационарном лечении в БУЗ «Воронежская областная детская больница №1».
Лечение проводили инсулином ультракороткого действия НовоРапид в дозах от 5 до 12 ед. При поступлении и выписке у больных определяли концентрацию глюкозы в крови глюкозоксидазным методом на анализаторе «Humаlizer» (Германия).
Сбор материала (при поступлении больных в стационар и выписке), приготовление временных препаратов буккального эпителия слизистой ротовой полости, их анализ осуществляли по разработанной ранее методике [11].
Для анализа микроядер отбирали отдельно лежащие клетки с непрерывным гладким краем ядра. Микроядро идентифицировали как хроматиновое тело округлой или овальной формы с гладким непрерывным краем, размером не более 1/3 ядра, лежащее четко отдельно от него, не преломляющее свет, имеющее интенсивность окрашивания и рисунок хроматина как у основного ядра и находящееся в одной плоскости с ядром [23]. Также проводили анализ других типов аберраций (протрузии типа «язык», «разбитое яйцо», насечки, перинуклеарные вакуоли), согласно рекомендациям Юрченко [24].
Для каждого обследуемого вычисляли частоту встречаемости клеток с микроядрами, перинуклеарными вакуолями, насечками, протрузиями типа «разбитое яйцо» и «язык» как отношение числа клеток с той или иной аберрацией к общему числу проанализированных клеток (в ‰), частоту аберраций всех типов – как отношение суммы клеток с перечисленными нарушениями к общему числу проанализированных клеток (в ‰). Определяли спектр нарушений как отношение числа клеток с той или иной аберрацией к общему числу клеток с нарушениями морфологии ядра (в %).
Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета статистической программы Stadia. Процедура группировки данных и их обработка изложены в работе Кулаичева [17]. Сравнивали частоту встречаемости буккальных эпителиоцитов с аномалиями у больных с использованием непараметрических Х–критерия Ван–дер–Вардена и Вилкоксона, так как распределение частот встречаемости аберрантных клеток не подчиняется нормальному закону. Для выявления влияния пола и лечения на частоту клеточных патологий и концентрацию глюкозы в крови использовали двухфакторный дисперсионный анализ. Силу влияния фактора определяли по Снедекору (в %). Сравнение частот нарушений в спектре проводили с использованием Z-апромаксимации для критерия равенства частот. Корреляционные связи между показателями вычисляли с использованием параметрического коэффициента корреляции (r).
Результаты исследования
и их обсуждение
Установлено влияние пола и лечения на уровень глюкозы в крови обследуемых лиц (сила влияния 8,2 % (Р < 0,001) и 7,8 % (Р < 0,001) соответственно).
Концентрация глюкозы в крови подростков при сахарном диабете I типа до лечения колебалась от 6,7 до 14,5 ммоль/л при среднем значении 9,8 ± 0,4 ммоль/л, после лечения – от 5,2 до 14,5 ммоль/л (различия достоверны (P < 0,05)) при средней величине данного показателя 8,7 ± 0,5 ммоль/л (табл. 1), что характерно для людей с сахарным диабетом после приема пищи [5].
Исследуемый показатель у юношей выше (как до, так и после лечения (10,3 ммоль/л и 9,5 ммоль/л соответственно)), чем у девушек (9,0 и 7,5 ммоль/л соответственно) (различия достоверны (P < 0,05)).
Таблица 1
Концентрация глюкозы в крови больных сахарным диабетом I типа до и после лечения
|
Номер пациента |
Концентрация глюкозы в крови, ммоль/л |
|||
|
Девушки |
Юноши |
|||
|
до лечения |
после лечения |
до лечения |
после лечения |
|
|
1 |
9,8 |
7,1 |
10,5 |
7,9 |
|
2 |
11,3 |
6,9 |
14,5 |
8,3 |
|
3 |
6,7 |
5,2 |
12 |
9,3 |
|
4 |
10 |
5,7 |
10,2 |
8,2 |
|
5 |
7,3 |
9,5 |
10,7 |
14,5 |
|
6 |
8,2 |
5,9 |
10,6 |
8,1 |
|
7 |
11 |
9,2 |
9,1 |
10,5 |
|
8 |
8,7 |
10,2 |
8,1 |
12,1 |
|
9 |
7,8 |
8 |
9,2 |
6,7 |
|
10 |
10,2 |
8,7 |
||
|
11 |
9,8 |
12,6 |
||
|
12 |
8 |
6,5 |
||
|
13 |
11,6 |
9,8 |
||
|
14 |
11,7 |
6,5 |
||
|
15 |
8,7 |
12,5 |
||
а
б
в
г
д
Рис. 1. Цитологические нарушения в клетках буккального эпителия больных сахарным диабетом I типа:
а – микроядра; б – протрузия типа «разбитое яйцо»; в – протрузия типа «язык»;
г – перинуклеарные вакуоли; д – насечки
В результате проведенных исследований в буккальных эпителиоцитах больных сахарным диабетом I типа обнаружены следующие цитологические нарушения: микроядра (рис. 1а), протрузии (типа «разбитое яйцо» (рис. 1б) и типа «язык» (рис. 1в)), перинуклеарные вакуоли (рис. 1г) и насечки (рис. 1д).
Частота встречаемости аберрантных клеток в буккальном эпителии больных представлена в табл. 2.
В результате исследований выявлено влияние пола, лечения и их совместное действие на частоту встречаемости разных типов аберраций в буккальном эпителии больных сахарным диабетом I типа (табл. 3).
Таблица 2
Частота встречаемости аберрантных клеток (в ‰) в буккальном эпителии больных сахарным диабетом I типа
|
Тип аберрации |
До лечения |
После лечения |
||||
|
Девушки |
Юноши |
Девушки + юноши |
Девушки |
Юноши |
Девушки + юноши |
|
|
Насечка |
0,4 ± 0,2 |
0 |
0,1 ± 0,1 |
0 |
0 |
0 |
|
Перинуклеарная вакуоль |
3,9 ± 0,5 |
2,7 ± 0,5* |
3,1 ± 0,4 |
3,5 ± 0,4 |
1,4 ± 0,3*** |
2,2 ± 0,31 |
|
Протрузия типа «разбитое яйцо» |
1,7 ± 0,4 |
0,7 ± 0,2 |
1,1 ± 0,2 |
1,2 ± 0,5 |
0,2 ± 0,2* |
1,2 ± 0,2 |
|
Протрузия типа «язык» |
0,6 ± 0,5 |
0,1 ± 0,1 |
0,3 ± 0,2 |
0 |
0 |
0 |
|
Микроядра |
1,9 ± 0,4 |
0,9 ± 0,2* |
1,3 ± 0,2 |
0,5 ± 0,3 |
0,7 ± 0,2* |
1,0 ± 0,2 |
|
Общее количество аберраций |
8,1 ± 1,2 |
4,4 ± 0,6** |
5,8 ± 0,7 |
6,3 ± 0,7 |
3,3 ± 0,3*** |
4,5 ± 0,4 |
Примечание: * – различия с показателем у девушек достоверны (P < 0,05), ** – различия с показателем у девушек достоверны (P < 0,01), *** – различия с показателем у девушек достоверны (P < 0,001), 1 – различия с показателем до лечения достоверны (P < 0,05).
Таблица 3
Влияние факторов лечения и пола на частоту аберраций в буккальном эпителии больных сахарным диабетом I типа
|
Тип аберрации |
Сила влияния (по Снедекору, %) |
||
|
пол |
лечение |
пол + лечение |
|
|
Насечка |
8,0*** |
8,0*** |
8,0*** |
|
Перинуклеарная вакуоль |
8,2** |
6,6*** |
- |
|
Протрузия типа «разбитое яйцо» |
- |
8,3** |
8,2* |
|
Протрузия типа «язык» |
8,3** |
- |
- |
|
Микроядра |
- |
7,7*** |
- |
|
Общее количество аберраций |
8,2*** |
4,5*** |
- |
Примечание: * – влияние фактора достоверно (P < 0,05);** – влияние фактора достоверно (P < 0,01); *** – влияние фактора достоверно (P < 0,001).
Общее число цитологических нарушений до лечения и после ниже величины, установленной у спортсменов (12,3 ± 0,6 ‰) [11], что может свидетельствовать о влиянии заболевание на генетический гомеостаз организма.
Общее число аберраций у юношей до и после лечения ниже (P < 0,01 и P < 0,001 соответственно), чем у девушек.
Уровень клеток с микроядрами до и после лечения ниже величины данного показателя, установленного другими авторами в популяции здоровых людей: 2,5 ± 0,1 ‰ [22] и 6,0 ± 0,4 ‰ [11].
Ранее было показано, что у людей, больных шизофренией, уровень клеток с микроядрами составил 2,3 ± 0,2 ‰ [13], при пародонтите – 0,2 ± 0,01 % [12].
Полученные нами данные свидетельствует о незначительном влиянии заболевания на генетическую стабильность организма.
Частота встречаемости клеток с микроядрами в буккальном эпителии ротовой полости подростков с сахарным диабетом
I типа как до, так и после лечения у юношей ниже, чем у девушек (различия достоверны (P < 0,05)), что можно объяснить особенностями метаболизма и различной активностью антиоксидантной системы в период полового созревания [18].
Маймуловым с соавт. [18] показано, что девочки, как дошкольники, так и подростки, в экологически неблагоприятных районах имели очень высокие уровни клеток с микроядрами по сравнению с мальчиками. Через сутки после однократного контакта с формальдегидом у женщин выявлена более высокая частота индуцированных микроядер, чем у мужчин [14]. Буториной с соавт. [2] было установлено, что различия между полами по частоте микроядер в клетках буккального эпителия достигают значимых уровней в детском возрасте. Ранее не было установлено различий между полами по частоте встречаемости микроядер при пародонтите, хотя их уровень существенно возрастал по сравнению с контрольной группой [12].
До лечения выявлены различия между полами по уровню клеток с протрузиями типа «разбитое яйцо» и перинуклеарными вакуолями (различия достоверны (P < 0,05)); после лечения – с перинуклеарными вакуолями (различия достоверны (P < 0,001)).
У юношей с сахарным диабетом I типа до и после лечения частота встречаемости многих нарушений (клеток с перинуклеарными вакуолями, насечками, протрузией «язык» и микроядрами) ниже, чем у юношей, занимающихся спортивными единоборствами [11]. Это обстоятельство свидетельствует о большей стабильности генома при данном заболевании. В то же время уровень клеток с протрузией «разбитое яйцо» выше при сахарном диабете.
В спектре нарушений ядра преобладают перинуклеарные вакуоли (53,8 % – до лечения и 48,9 % – после лечения) (рис. 2), которые являются показателем некроза клеток [23]. Однако ранее в исследованиях на спортсменах было выявлено, что в буккальном эпителии ведущим типом аберраций являются микроядра [11]. Таким образом, наибольшее число клеток с перинуклеарными вакуолями может служить характерной особенностью буккального эпителия подростков при сахарном диабете I типа.
до лечения после лечения
Рис. 2. Спектр нарушений в клетках буккального эпителия
больных сахарным диабетом I типа до и после лечения
После лечения инсулином происходит снижение частоты встречаемости перинуклеарных вакуолей, протрузий типа «язык» и насечек (различия достоверны (P < 0,05)), что, возможно, обусловлено нормализацией биохимических показателей крови (концентрации глюкозы).
Анализ спектра цитологических нарушений у девушек и юношей до и после лечения представлен на рис. 3. Характерной особенностью буккального эпителия юношей является отсутствие клеток с насечками до лечения, после лечения происходит увеличение числа клеток с протрузиями типа «разбитое яйцо» (различия достоверны (P < 0,05)) и снижение количества клеток с перинуклеарными вакуолями (различия достоверны (P < 0,001)). У девушек после лечения исчезают клетки с насечками и протрузиями типа «язык».
Увеличение уровня глюкозы в крови приводит к увеличению числа клеток с протрузией типа «язык» (r = 0,4, P < 0,05) до лечения и количества клеток с насечками и протрузией типа «язык» после лечения (r = 0,5, P < 0,01; r = 0,5, P < 0,01 соответственно), которые служат показателями увеличения разорванных хромосомных мостов и количественных нарушений хромосом [16, 21] (рис. 4).
У девушек до лечения выявлена связь показателя уровня глюкозы в крови с общим количеством аберрантных клеток (r = 0,7, P < 0,05) и клеток с перинуклеарными вакуолями (r = 0,7, P < 0,05), наличие которых свидетельствует об увеличении некротических процессов и общей деградации ДНК при повышенной концентрации глюкозы в крови. После курса лечения отсутствует связь между исследуемыми показателями, что может свидетельствовать об улучшении общего состояния организма.
У юношей до лечения отмечается корреляция уровня глюкозы в крови с общим количеством нарушений в буккальном эпителии (r = 0,5, P < 0,05), насечками (r = 0,5, P < 0,05), числом клеток с протрузиями типа «язык» (r = 0,5, P < 0,05). После лечения к перечисленным корреляциям добавляется связь с частотой встречаемости протрузии типа «разбитое яйцо» (r = 0,6, P < 0,01).
а
б
в
г 
Рис. 3. Спектр цитологических нарушений в клетках буккального эпителия девушек (а, б) и юношей (в, г) с сахарным диабетом I типа до (а, в) и после лечения (б, г)
Рис. 4. Корреляционные связи между уровнем глюкозы в крови и цитологическими нарушениями разных типов в клетках буккального эпителия подростков, больных сахарным диабетом I типа.
Обозначения: __________ – коэффициент корреляции от 0,3 до 0,59,
___ . ___ . ___ – коэффициент корреляции от 0,6 до 0,99
Таким образом, на основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. Установлено влияние пола и инсулинотерапии на концентрацию глюкозы в крови подростков с сахарным диабетом I типа.
2. Отмечаются половые различия в уровне нарушений: у юношей частота встречаемости почти всех типов аберраций ниже, чем у девушек; отсутствуют насечки, после лечения инсулином отмечается увеличение числа клеток с протрузиями типа «разбитое яйцо» и снижение количества клеток с перинуклеарными вакуолями. У девушек после лечения происходит снижение уровня клеток с протрузиями типа «язык» и насечками.
3. Выявлена положительная корреляционная связь концентрации глюкозы в крови с частотой встречаемости протрузии типа «язык» при сахарном диабете I типа. У девушек до лечения отмечаются корреляционные связи между показателями уровня глюкозы в крови с общим количеством аберрантных клеток и клеток с перинуклеарными вакуолями, после лечения отсутствуют зависимости между изученными показателями. У юношей до и после лечения обнаруживается корреляция уровня глюкозы в крови с общим количеством нарушений в буккальном эпителии, клеток с насечками и протрузией типа «язык», также после лечения добавляется корреляционная связь концентрации глюкозы в крови с частотой протрузии типа «разбитое яйцо».
4. При проведении микроядерного теста в буккальном эпителии необходимо учитывать концентрацию глюкозы в крови, так как это может отразиться на его результатах.
Рецензенты:
Дурнова Н.А., д.б.н., доцент, зав. кафедрой общей биологии, фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, Саратов;
Кашин А.С., д.б.н., профессор кафедры общей биологии, фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, г. Саратов.
Работа поступила в редакцию 16.10.2012.