Хорошо известно, что практически все ферменты, в частности внутриклеточные, никогда не функционируют в условиях, отвечающих классической кинетике Михаэлиса-Ментен, так как они находятся в сложной гетерогенной системе клетки. Сегодня доказано, что ферменты большинства метаболических путей связаны с теми или иными мембранными структурами клетки. При этом ферменты, действующие в гетерогенном окружении, приобретают новые свойства, которые отсутствуют у тех же ферментов, когда они находятся в разбавленном растворе [4].
Одной из наиболее изученных клеточных моделей, в состав которой входят различные мультиэнзимные комплексы, является эритроцит. Данная клетка чрезвычайно интересна тем, что в ее ферментативном ансамбле присутствуют ферменты биотрансформации ксенобиотиков. Одним из таковых является альдегиддегидрогеназа (КФ 1.2.1.3., АлДГ). Особенности регуляции АлДГ эритроцита до сих пор в научной литературе представлены крайне фрагментарно, особенно это касается различных молекулярных форм фермента [5, 6, 7, 8]. Остается невыясненной физиологическая роль взаимодействия АлДГ с мембраной эритроцитов.
Целью данной работы явилось выявление топохимии надмолекулярных форм альдегиддегидрогеназы эритроцитов крови человека.
Материал и методы исследования
Кровь для исследования брали у практически здоровых людей из локтевой вены с 4%-м раствором цитрата натрия (соотношение 9:1) с соблюдением всех необходимых правил в условиях медицинского стационара. Эритроциты осаждали (800g; 10 мин), промывали 5-кратным объемом 0,15М NaCl с 10мМ трис-НСl (рН 7,4), гемолизировали, через 30 мин центрифугировали (16000g; 10 мин) [3]. Активность АлДГ определяли в «тенях» эритроцитов и супернатанте [2]. Солюбилизацию эритроцитарной АлДГ проводили путем однократного суспендирования «теней» эритроцитов в 0,15 М и 0,3 М растворах КСl. Определяли следующие кинетические характеристики альдегиддегидрогеназы: Kt, Vmax, Vmax/Kt (Кa) [1], где Kt - время достижения Vmax ферментативной реакции (мин); Vmax - максимальная скорость накопления продукта реакции при полном расходовании субстрата (мкмоль/мин); Vmax/Kt (Кa) - коэффициент каталитической эффективности ферментативной реакции (мкмоль/мин2) [1]. Статистический анализ результатов исследований выполнен с использованием программы Statistica 6.
Результаты исследования и их обсуждение
Проведенные исследования показали, что активность фермента в «тенях» эритроцитов, которые представляют мембрану данных клеток, составила 51,3% от общей активности АлДГ в гемолизате клеток, а в матриксе эритроцитов - 45,2% (табл. 1).
Таблица 1
Распределение активности альдегиддегидрогеназы во фракциях эритроцитов крови человека (нмольНАДН/мин×мг белка)
|
Фракции эритроцита |
Активность фермента |
|
Гемолизат эритроцитов |
195,93 ± 4,26 |
|
Матрикс эритроцитов |
88,48 ± 2,64 p = 0,002 |
|
«Тени» эритроцитов |
100,45 ± 1,54 p = 0,003 |
Учитывая, что активность альдегиддегидрогеназы во фракции «теней» эритроцитов выше, чем в матриксе, можно полагать, что АлДГ - преимущественно мембранносвязанный фермент. Поэтому дальнейшие эксперименты с мембранной формой альдегиддегидрогеназы были посвящены определению прочности связи фермента с мембраной эритроцита.
Однократное воздействие на фрагменты мембран эритроцитов 0,15М раствором КСl приводит к статистически значимому снижению активности альдегиддегидрогеназы в «тенях» данных клеток на 39,5%, а также увеличению активности фермента на 53,3% в супернатанте, полученном после центрифугирования (табл. 2).
Однократная солюбилизация мембраносвязанной альдегиддегидрогеназы эритроцитов 0,3М раствором КСl вызывает статистически значимое увеличение активности АлДГ в супернатанте на 65,5% и уменьшение в «тенях» эритроцитов на 49,1% (см. табл. 2).
Полученные результаты исследования позволяют предположить, что альдегиддегидрогеназа находится в эритроцитах, как минимум в трех основных надмолекулярных формах (матриксная форма, лабильно связанная с мембраной форма АлДГ и прочносвязанная с мембраной эритроцитов форма фермента).
В табл. 3 представлена кинетическая характеристика альдегиддегидрогеназы различных фракций эритроцита.
Таблица 2
Активность альдегиддегидрогеназы после солюбилизации с мембраны эритроцитов под влиянием 0,15М и 0,3М KCl (нмольНАДН/мин∙мг белка)
|
Условия эксперимента |
Супернатант |
«Тени» эритроцитов |
|
До солюбилизации |
- |
100,45 ± 1,54 |
|
После солюбилизации 0,15М раствором КСl |
189,53 ± 7,84 p = 0,009 |
60,73 ± 2,58 p = 0,019 |
|
После солюбилизации 0,3М раствором КСl |
256,23 ± 6,91 p = 0,004 |
51,09 ± 1,77 p = 0,012 |
Таблица 3
Кинетическая характеристика альдегиддегидрогеназы различных фракций эритроцитов крови человека (Kt, Vmax, Ka)
|
Фракции эритроцита |
Kt |
Vmax |
Ka |
|
Гемолизат эритроцитов |
1,20 ± 0,17 |
0,38 ± 0,06 |
0,32 ± 0,02 |
|
«Тени» эритроцитов |
0,54 ± 0,08 p = 0,031 |
0,85 ± 0,08 p = 0,016 |
1,57 ± 0,06 p = 0,007 |
|
Матрикс эритроцитов |
0,87 ± 0,04 p = 0,043 |
0,48 ± 0,02 |
0,55 ± 0,03 p = 0,038 |
Видно, что сродство к субстратам реакции (Kt) и коэффициент каталитической эффективности (Ka) мембранносвязанной АлДГ («тени» эритроцитов) выше, чем у альдегиддегидрогеназы в матриксе и гемолизате эритроцитов.
Использование KCl для солюбилизации АлДГ с мембраны эритроцитов позволило выявить определенную закономерность в изменении кинетической характеристики данного фермента. В частности, по мере удаления части АлДГ с мембраны эритроцитов, сродство фермента к субстратам реакции возрастает (табл. 4). При этом в супернатанте значение Kt, наоборот, возрастает.
Предполагается, что мембранная форма АлДГ неоднородна и представлена, как минимум, двумя формами фермента: лабильно- и прочносвязанной, на что указывают данные по солюбилизации КСl (0,15М и 0,3М) (см. табл. 4).
Таблица 4
Кинетические характеристики альдегиддегидрогеназы после солюбилизации с мембраны эритроцитов под влиянием 0,15М и 0,3М KCl (Kt, Vmax, Ka)
|
Фракции эритроцита |
Kt |
Vmax |
Ka |
|
|
«Тени» эритроцитов |
До солюбилизации |
0,54 ± 0,08 |
0,85 ± 0,08 |
1,57 ± 0,06 |
|
0,15М KCl |
0,43 ± 0,05 |
0,94 ± 0,07 |
2,19 ± 0,08 p = 0,021 |
|
|
0,3М KCl |
0,36 ± 0,04 |
1,15 ± 0,09 p = 0,016 |
3,20 ± 0,07 p = 0,007 |
|
|
Супернатант |
0,15М KCl |
0,65 ± 0,04 |
0,66 ± 0,06 |
1,02 ± 0,05 |
|
0,3М KCl |
0,72 ± 0,05 |
0,64 ± 0,05 |
0,89 ± 0,04 |
|
Таким образом, можно полагать, что альдегиддегидрогеназа, вернее, ее различные надмолекулярные формы, имеют определенную топохимическую организацию в эритроцитах крови человека, что играет определяющее значение для регуляции данного фермента биотрансформации в клетке.
Рецензенты:
-
Веселов А.П., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биохимии и физиологии растений, декан биологического факультета ГОУ ВПО «ННГУ им. Н.И. Лобачевского», г. Нижний Новгород;
-
Корягин А.С., д.б.н., профессор кафедры физиологии и биохимии человека и животных ГОУ ВПО «ННГУ им. Н.И. Лобачевского», г. Нижний Новгород.
Работа поступила в редакцию 09.04.2012