Сигнальные пути апоптоза, так или иначе, ведут к поражению митохондриальной мембраны и нарушению процессов окислительно-восстановительных реакций в дыхательной цепи, которую составляют более 70 энзимов, коферментов и активных факторов [1, 3, 5, 10].
Важнейшими звеньями окислительной системы являются сукцинатдегидрогеназа и цитохромоксидаза, расположенные соответственно в начале и в конце дыхательной цепи [7, 8, 14]. Эти два фермента, как показывают спектрометрические исследования, находятся в эквимолекулярных взаимоотношениях и организованы в кристах митохондрии комплексными ансамблями с правильными промежутками. По активности сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы можно судить об уровне энергетических функций клетки, состоянии цикла Кребса и редокс-процессах в нейроне. Падение активности окислительных ферментов при феномене гипервозбудимости коррелирует с состоянием митохондрий в апоптотических клетках [9, 12, 13, 15]. Стадия конденсации и маргинации ядерного хроматина характеризуется наличием в клетке митохондрий округлой и/или овальной формы с хорошо выраженными кристами, однако по мере углубления процесса умирания и вакуолизации цитоплазмы (блеббинг) количество крист в митоходриях резко уменьшается [2, 4, 6, 11].
Материалы и методы исследования
Экспериментальная часть работы состояла в комплексном исследовании состояния нейронов височной коры крыс в условиях эпилептической гипервозбудимости и оксислительного стресса. Для этого нейроны идентифицировали в соответствии с их морфологическим типом, медиаторной и нейрохимической специализацией. Определяли изменения активности сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы, а затем исследовали апоптотический индекс корковых нейронов в фокусах эпилептического повреждения. Основной раздел работы составили исследования, выполненные на материале 35 нелинейных крыс-самцов массой 250-300 г, содержащихся в стандартных условиях вивария.
Формирование локальных очагов перевозбуждения корковых нейронов вызывали путем введения раствора каиновой кислоты - селективного агониста одноименных глутаматных рецепторов. Каинат оказывает проконвульсантное действие и одновременно при экзогенном подведении выступает как нейродеструктивный фактор, который потенцирует возникновение феномена цитотоксичности. Избирательное действие каината на глутаматные рецепторы реализуется в формировании стойких очагов эпилептиформной активности, которые на поведенческом уровне проявляются в виде судорог, агрессии, адипсии и афагии.
Каиновую кислоту (Sigma) вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг каждый час до наступления эпилептического статуса. Через 1,5 часа судорожного синдрома, соответствующего статусу, крысам вводили диазепам в дозе 4 мг/кг. Животных умерщвляли через 2,5 часа, на 1, 3, 5, 7 и 21 сутки посредством передозировки эфирного наркоза.
Височная (слуховая) область новой коры у крыс соответствует координатам в положении брегма от -5,3 до -6,3 мм. Срезы изготавливали в поперечной и сагиттальной плоскостях, принимая во внимание различную ориентацию исследуемых клеток в трехмерном пространстве коры. Морфологические изменения нейронов в очагах эпилептического повреждения изучали с помощью метода Гольджи и Кахаля. Для уточнения топологии и соматодендритной морфологии клеток часть срезов височной коры докрашивали толуидиновым синим по методу Ниссля, гематоксилином-эозином, железным гематоксилином и по методу Романовского-Гимза. Активность сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы определялась по методу Нахласа. Присутствие ферментов в нейронах при использовании в качестве акцепторов водорода нитро-СТ устанавливается по наличию гранул диформазана интенсивно синего цвета, которые обнаруживаются в цитоплазме и отсутствуют в ядре.
Результаты исследования и их обсуждение
Сукцинатдегидрогеназа представляет собой флавопротеид и катализирует дегидрирование янтарной кислоты в фумаровую [15]. Сукцинатдегидрогеназа локализована на внутренней поверхности внутренней митохондриальной мембраны, где она передает восстановительные эквиваленты дыхательной цепи на уровне убихинона. Заметные изменения активности фермента наблюдаются спустя трое суток от начала эксперимента.
К этому времени отмечается уменьшение величины цитоплазматических гранул и снижение интенсивности их окраски, что особенно заметно в клетках с эктопированным ядром. В таких элементах интенсивно синие гранулы лежат кольцом вокруг прозрачного ядра. Максимальное угнетение активности энзима нами отмечены на 7-е сутки от начала каинат-индуцированного эпилептического статуса (табл. 1). В этот период цитоплазма нейронов выглядит в значительной степени обесцвеченной, так как содержит минимальное количество мелких гранул голубого или лилового цвета.
Таблица 1
Активность сукцинатдегидрогеназы в эпилептическом очаге головного мозга крысы при каинатном киндлинге (в ЕОП)
|
Этапы эксперимента |
Контроль |
Каинат |
|
1-е сутки |
3,9 ± 0,30 |
3,8 ± 0,2 |
|
3-и сутки |
--- |
3,0 ± 0,3 |
|
5-е сутки |
--- |
1,1 ± 0,02* |
|
7-е сутки |
--- |
0,4 ± 0,08* |
Примечание: здесь и далее * - р < 0,05 по отношению к контролю.
Цитохромоксидаза - гемопротеин, который служит конечным компонентом цепи дыхательных переносчиков, локализованных в митохондриях, и катализирует реакцию, в результате которой электроны, высвобождающиеся из молекул субстрата при окислении их дегидрогеназами, переносятся на конечный акцептор - кисло- род [6, 11].
Иногда цитохромоксидазу называют цитохромом а3. Первоначально полагали, что цитохром а и цитохром а3 - это автономные гемопротеины. В дальнейшем было показано, что эти два цитохрома входят в состав комплекса, который получил название цитохром аа3. Он содержит две молекулы гема, в каждой из которых атом железа может переходить из состояния Fe2+ в состояние Fe3+ и обратно в ходе окисления и восстановления, а также два атома Сu, каждый из которых взаимодействует с одним из гемов.
Изменение активности цитохромоксидазы во многом сходны с изменениями сукцинатдегидрогеназы. На третьи сутки от начала каинатного киндлинга активность цитохромоксидазы снижалась как в мелких, так и крупных нейронах. В цитоплазме уменьшалось количество гранул. В части нейронов ядро занимало краевое положение. На 5-е сутки от начала эксперимента угнетение функций фермента становится более заметным. Цитоплазма поврежденных нейронов содержит мелкие бледно-голубые и фиолетовые гранулы диформазана (табл. 2).
Таблица 2
Активность цитохромоксидазы в эпилептическом очаге головного мозга крысы при каинатном киндлинге (в ЕОП)
|
Этапы эксперимента |
Контроль |
Каинат |
|
1-е сутки |
3,55 ± 0,50 |
3,44 ± 0,2 |
|
3-и сутки |
--- |
2,9 ± 0,5 |
|
5-е сутки |
--- |
1,6 ± 0,32* |
|
7-е сутки |
--- |
0,5 ± 0,12* |
Наши исследования показали, что апоптотический демонтаж нейронов в очаге эпилептиформной активности сочетается с изменением активности окислительных ферментов. Гиперфункция нейроцитов эпилептического очага, направленная на восстановление утраченных связей и реактивный коллатеральный рост, ведет к неспецифическим клеточным реакциям. По мере прогрессирования эпилептогенеза при продолжающемся статусе судорожных припадков активность оксиредуктаз постоянно снижается, что указывает на альтерацию жизненноважных функций нейрона и по времени совпадает с появлением наибольшего количества TUNEL-позитивных элементов II-III слоев височной коры [6, 8, 9]. Снижение активности окислительных ферментов дыхательной цепи при синдроме гипервозбудимости максимально выражено на 7-е сутки эксперимента.
Заключение
Терминальный цитохром аа3 (цитохромоксидаза) осуществляет конечную стадию процесса - перенос восстановительных эквивалентов на молекулярный кислород. Цитохромоксидаза имеет очень высокое сродство к кислороду, что позволяет дыхательной цепи функционировать с максимальной скоростью до тех пор, пока в ткани практически не будет исчерпан весь О2 . При эпилептическом статусе эффективность работы митохондрий может регулироваться несколькими лимитирующими скорость дыхания факторами: доступностью АДФ и субстратов, возможностями самой дыхательной цепи при насыщающих количествах всех субстратов и компонентов и доступностью кислорода. В условиях гипоксии и окислительного стресса при эпилептической эксайтотоксичности неизбежно страдает каждое из этих звеньев, что отражается на активности митоходриальных оксидаз. Кроме того, избыточная наработка свободных радикалов ведет к активации перекисного окисления липидов (ПОЛ). Образование и накопление диеновых конъюгатов увеличивает полярность гидрофобных углеводородных хвостов жирных кислот, которые образуют липидный бислой мембраны, и ведет к повышению проницаемости мембран, нарушению активности мембрано-связанных ферментов и ионного транспорта. Интенсификация ПОЛ способствует полному разрушению ненасыщенных липидов мембран, нарушениям структуры и функции белков, нуклеиновых кислот и в конечном итоге - гибели клетки.
Рецензенты:
-
Черток В.М., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой нормальной анатомии ГБОУ ГВПО «Владивостокский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития Российской Федерации, г. Владивосток;
- Матвеева Н.Ю., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой гистологии ГБОУ ГВПО «Владивостокский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития Российской Федерации, г. Владивосток.
Работа поступила в редакцию 23.04.2012.