Проблема рассеянного склероза (РС) обусловлена ежегодным увеличением количества людей, страдающих этим заболеванием. Изучение причин возникновения, развития и лечения этого крайне тяжелого заболевания ЦНС по актуальности занимает одно из ведущих мест в неврологической практике [5], являясь приоритетным направлением современной медицины. Рассеянный склероз - это клинически неоднородное хроническое демиелинизирующее заболевание нервной системы неизвестной этиологии. При РС повышается концентрация IgG, в составе которых обнаруживаются специфические антитела (АТ) против различных компонентов миелина; выявлены антиядерные антитела к ДНК, антитела к другим структурам и тканям организма [3]. Патогенетическое и клиническое значение этих антител изучено недостаточно. В последние годы показано, что антитела к нативной и денатурированной ДНК могут играть роль в развитии рассеянного склероза. Частота встречаемости этих АТ значительно выше у пациентов с неблагоприятным течением заболевания [2], а также имеет место при динамическом наблюдении в активную фазу заболевания [1], что указывает на тесную связь выработки АТ с основными стадиями развития заболевания. Уровни антинуклеарных антител могут существенно различаться не только в зависимости от индивидуальной иммунореактивности пациента, от характера и стадии заболевания, но и как факт аутоиммунного ответа как на нативную, так и на денатурированную ДНК [1].
При РС наблюдается углубление деструктивных процессов, что может проявляться в усилении эндогенной интоксикации, характеризуемой спектром молекул средней массы. Это вещества белковой природы с молекулярной массой 300-5000 дальтон (Да), в связи, с чем их часто называют молекулами средней массы (МСМ) или среднемолекулярными пептидами (СМП) [6]. МСМ получили известность как важные универсальные факторы интоксикации. Определение МСМ различной природы в сыворотке крови у психических и неврологических больных является информативным [7] .
Деструктивные процессы, лежащие в основе неспецифического синдрома эндогенной интоксикации, как правило, связаны с активацией окислительного стресса, и сопровождаются нарушениями структуры и функции мембран [14]. Накопление МСМ является не только маркером эндотоксикации, но и фактором, усугубляющим течение патологического процесса - приобретая роль вторичных токсинов, они вызывают расстройство гематоэнцефалического барьера, микроциркуляторного русла, ингибируют митохондриальные процессы окисления, нарушают транспорт аминокислот [6]. Выявлено почти полное разобщение окисления и фосфорилирования, нарушение механизмов регуляции интенсивности дыхания адениловыми нуклеотидами под влиянием МСМ. Одним из возможных механизмов нейротоксичного действия МСМ является ингибирование механизма активного транспорта ионов натрия и калия через мембрану клеточных элементов тканей ЦНС.
Целью настоящего исследования явилось изучение особенности спектра молекул средней массы и частоты встречаемости антител к нативной и денатурированной ДНК у больных с различными типами течения рассеянного склероза.
Материалы и методы исследования
С помощью диагностических критериев McDonald [12] проведено комплексное клинико-биологическое обследование 65 больных с верифицированным диагнозом рассеянного склероза, проходивших курс терапии в неврологической клинике Сибирского государственного медицинского университета (Томск) или состоящих на амбулаторном учете. В качестве контрольной группы для лабораторных исследований проведено обследование 27 практически здоровых лиц, соответствующих по полу и возрасту изучаемым пациентам. Исследование проведено с соблюдением биоэтических норм согласно протоколу, утвержденному локальным биоэтическим комитетом. Средний возраст больных на момент обследования составил 35,7 лет (от 16 до 58 лет), средний возраст начала заболевания 29,50 (12-47) лет и длительность болезни 10,35 ± 7,19 лет (от 1 года до 19 лет). Женщины составили 61,12% всех больных (39 человек), мужчины - 38,88% (23 человек).
Выраженность неврологического дефицита оценивалась по функциональным шкалам Куртцке [11] с определением суммы баллов неврологического дефицита (FS) и степени инвалидизации (EDSS). Скорость прогрессирования определялась как отношение балла EDSS к длительности заболевания, у больных с РС она имела значение 0,79 ± 0,01 (0,25-1,86) (p = 0,002).
У 39 (58,06%) больных диагностирован ремиттирующий тип течения болезни (РРС), у 19 (30,62%) - вторично-прогрессирующий (ВПРС), у 7 (11,29%) - первично-прогрессирующий (ППРС).
В качестве материала для лабораторных исследований использовалась сыворотка периферической крови пациентов. Параметры эндогенной интоксикации оценивали по спектру молекул средней массы в сыворотке крови скрининговым методом [8] в нашей модификации [7]. Принцип метода основан на освобождении сыворотки крови от содержащихся в ней высокомолекулярных пептидов и белков с использованием трихлоруксусной кислоты и количественном определении в полученной после центрифугирования надосадочной жидкости уровня СМП по поглощению в монохроматическом световом потоке при длине волн 280, 254, 230 нм. Результаты выражали в единицах оптического поглощения. При длине волны 280 нм (ед. А280) выявляется фракция МСМ280, содержащая ароматические аминокислоты; при 254 нм (ед. А254) - фракция МСМ254, не содержащая аминокислот - продукты неполного распада белков, обладающие токсическим влиянием; при 230 нм (ед. А230) - фракция МСМ230, связанная с остатками нуклеиновых кислот.
Для иммуноферментного определения IgG-антител к одноцепочечной и двуцепочечной ДНК в сыворотке крови использовали тест-системы «Векто-ssДНК-IgG» и «Векто-dsДНК-IgG» производства ЗАО «Вектор-Бест» (Россия). Относительное содержание анти-ДНК АТ в исследуемых образцах выражали в единицах оптического поглощения при 450 нм (ед. А450).
Статистический анализ и обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica, версия 6.0 для Windows (StatSoft. Inc., 2001). Достоверность различий определяли по t-критерию Стьюдента и с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни для независимых выборок. Различия считали статистически значимыми при достигнутом уровне значимости р < 0,05. Данные представлены в виде средней величины и стандартного отклонения М ± SD. При оценке результатов исследований использован метод корреляционного анализа, с расчетом коэффициента парной корреляции по Пирсону.
Результаты исследования и их обсуждение
Изучение клинического материала проводилось в зависимости от типа течения рассеянного склероза. Средний возраст пациентов с РРС составил 31 год (21-37); с ВПРС - 44 года (32-45) и с ППРС - 5 лет (52-56). При РРС средний возраст дебюта заболевания - 23 года, сумма неврологического дефицита - 7 баллов при средней скорости прогрессирования 0,433 (0,25-0,72) и средняя степень инвалидизации больных по шкале Kurtzke - 2,5 ± 1,45 балла. У пациентов при ВПРС средний возраст дебюта заболевания составил 28 лет, сумма неврологического дефицита - 10 баллов при средней скорости прогрессирования 0,671 (0,34-1,08) и средняя степень инвалидизации больных по шкале Kurtzke - 3,5 ± 1,37 балла. У пациентов при ППРС средний возраст дебюта заболевания составил 44 года, сумма неврологического дефицита - 15 баллов при средней скорости прогрессирования 0,863 (0,65-1,86) и средняя степень инвалидизации больных по шкале Kurtzke - 4,0 ± 0,75 балла.
Таким образом, максимальная степень инвалидизации по шкале Куртцке выявлена у пациентов с ППРС. Наибольшая выраженность неврологических нарушений у пациентов с умеренной и тяжелой инвалидизацией отмечалась в период от 5 до 10 лет от начала болезни. При длительности заболевания более 10 лет благоприятное течение PC наблюдалось преимущественно у более молодых пациентов с РРС.
Первично-прогрессирующий PC часто дебютировал в более зрелом возрасте, чем ремиттирующий PC. Известно, что рассеянный склероз характеризуется непрекращающимся во времени процессом и проявляется клинически в виде периодов обострений или в форме непрерывно прогрессирующего процесса с быстрым развитием инвалидизации. Среди обследованных пациентов с РРС ремиссия наблюдалась у 23 человек, обострение болезни - у 16 человек. Обострение при ВПРС было у 7 пациентов, без обострения обследовано 12 пациентов.
Количественное определение АТ к нативной и денатурированной ДНК, а также исследование спектра МСМ целесообразно использовать в целях правильной диагностики, мониторинга состояния и прогноза у пациентов РС. Проведенное исследование показало, что в общей группе у 56% больных РС концентрация АТ к нативной ds-ДНК в крови выше физиологических значений, средняя концентрация АТ против денатурированной ss-ДНК была выше у 67% больных РС.
При анализе в зависимости от типа течения заболевания физиологическому диапазону концентраций АТ против денатурированной ДНК соответствует 6% больных с РРС, 68% - с ВПРС и 86% пациентов - с ППРС. Физиологический диапазон концентраций АТ против нативной ДНК наблюдается у 73,3% больных с РРС, у 86% - с ВПРС и у 100% - с ППРС. Можно полагать, что в первую очередь происходит понижение наработки АТ против нативной ДНК у пациентов с РРС, более благоприятного типа течения РС.
Из данных о среднем содержании антинуклеарных АТ (рисунок) видно, что уровень антител к нативной ДНК достоверно ниже, чем к денатурированной ДНК, как в общей группе больных - так и в каждой из групп с различным типом течения РС. Это может указывать в пользу того, что клоны, продуцирующие АТ к нативной ДНК, способны быстрее элиминироваться, а клоны, продуцирующие АТ к продуктам деградации ДНК - однотяжевым структурам, дольше сохраняются в организме.
В то же время установлена достоверная прямая корреляция между уровнями АТ к нативной и к денатурированной ДНК у всех больных с РС, коэффициент корреляции равен r = 0,82 (в контрольной группе - r = 0,63). Внутри каждой группы с разным типом течения РС эти показатели также достоверно коррелировали между собой, коэффициенты корреляции: r = 0,85 - для группы РРС, r = 0,61 и r = 0,66 - для групп с ВПРС и ППРС соответственно.
Обнаруженные прямые корреляционные связи между содержанием АТ к нативной и денатурированной ДНК у больных при разных типах и стадиях течения РС отражают патогенетическую взаимосвязь между развитием деструктивных, воспалительных процессов и активацией гуморального иммунного ответа, а также указывают на связь выработки АТ с основными типами и стадиями развития заболевания.
Уровень антител к ДНК при разных типах течения рассеянного склероза (в% от значений контрольной группы). Примечание: * - р < 0,05 - достоверность различий по сравнению с контрольной группой
Таблица 1
Коэффициенты корреляции между уровнями АТ к нативной и к денатурированной ДНК у пациентов с РРС и ВПРС в разных стадиях заболевания
|
Показатели |
РРС Ремиссия n = 23 |
РРС Обострение n = 16 |
ВПРС Без обострений n = 12 |
ВПРС Обострение n = 7 |
|
R - коэффициент корреляции |
0,70 р < 0,005 |
0,86 р < 0,005 |
0,36 р > 0,05 |
0,68 р < 0,005 |
Рассеянный склероз не одностадийный процесс [15], начальной воспалительной фазе при РРС соответствует высокий уровень пролиферации антител к ДНК и развитие процессов эндотоксикоза. Затем, для более позднего периода заболевания, характерна нейродегенеративная фаза, напрямую связанная с разрушением нервных тканей организма [9], сопровождающаяся усилением эндогенной интоксикации, характеризуемой спектром МСМ.
Одним из показателей деструктивных процессов являются показатели МСМ. Спектр молекул средней массы в сыворотке крови: МСМ280, МСМ254, МСМ230 у обследованных пациентов с РС в зависимости от типа течения и у здоровых лиц приведен в табл. 2.
Таблица 2
Характеристика спектра МСМ в сыворотке крови при различных типах течения РС, (M ± SD)
|
Показатель |
Все группы РС в целом n = 65 |
РРС n = 39 |
ВПРС n = 19 |
ППРС n = 7 |
Контрольная группа n = 27 |
|
МСМ280 усл.ед. А280 |
0,28 ± 0,10 |
0,28 ± 0,07 |
0,29 ± 0,15 |
0,23 ± 0,06 |
0,29 ± 0,09 |
|
МСМ254 усл.ед. А254 |
0,34 ± 0,10 |
0,35 ± 0,10 |
0,32 ± 0,10 |
0,31 ± 0,10 |
0,32 ± 0,07 |
|
МСМ230 усл.ед. А230 |
0,70 ± 0,50 p < 0,05 |
0,67 ± 0,54 p < 0,05 |
0,73 ± 0,45 p < 0,05 |
0,89 ± 0,41 p < 0,05 |
0,31 ± 0,15 |
Примечание. р < 0,05 - достоверность различий по сравнению с контрольной группой.
В ходе исследования МСМ у пациентов с РС в зависимости от типа течения выявлено изменение спектра молекул средней массы в сторону достоверного увеличения их нуклеарной фракции МСМ230 при всех типах течения РС, причем степень увеличения соответствует повышению тяжести РС. У пациентов с РРС уровень МСМ этой фракции в 2,2 раза, у пациентов с ВПРС - в 2,4 раза, у пациентов с ППРС - в 2,9 раз выше, чем в контроле. В небольшой степени и статистически недостоверно изменяются ароматическая - МСМ280 фракция, содержащая ароматические нетоксические аминокислоты, и токсическая - МСМ254. Увеличение нуклеарной фракции МСМ230, возможно, связано с накоплением в крови остатков нуклеиновых кислот в результате усиления апоптического разрушения клеток [4, 13], а также повышенного распада белков при рассеянном склерозе. Все это подтверждает гибель клеток, в результате окислительного стресса играющего особо значимую роль в патогенезе PC [10]. Кроме того, используемые в фармакотерапии РС глюкокортикоиды оказывают выраженное воздействие на показатели гибели клеток, являясь индукторами апоптоза. Это, возможно, относится к переходу болезни в нейродегенеративную фазу, напрямую связанную с недостаточностью гематоэнцефалического барьера, а именно, с повышением его проницаемости и разрушением нервных тканей организма [15].
Следует отметить, что увеличение нуклеарной фракции МСМ при РС находится в соответствии с изменением уровня антител к ДНК. Повышение уровня МСМ и содержания антител к ДНК у больных РС, вероятно, обусловлено усилением их образования в тканях и патологией их элиминации из организма либо сочетанием обоих механизмов.
При анализе состояния гуморального иммунного ответа по уровню антител к нативной и денатурированной ДНК в сыворотке крови у больных с РС обнаруживается максимальный уровень антител к обеим молекулам ДНК при ремиттирующем типе течения РС (см. рисунок). С увеличением тяжести патологического процесса (при прогрессирующих типах течения РС - ВПРС и ППРС) степень повышения титра антител резко убывает. Гуморальный ответ при ППРС наиболее угнетён. Выработка АТ против нативной и денатурированной ДНК у больных РС зависит от индивидуальных особенностей пациентов и характера протекания РС. В целом, в период обострения у пациентов с РРС наблюдается тенденция более выраженного повышения (0,601 ± 0,485 ед. А450) АТ против денатурированной ДНК, уровень которых заметно снижается в период ремиссии (0,549 ± 0,163 ед. А450). У лиц контрольной группы АТ к денатурированной ДНК составляют 0,202 ± 0,007 ед. А450.
Таким образом, проведенное исследование у больных рассеянным склерозом показало, что на фоне выраженной клинической симптоматики высокие уровни антител к нативной и денатурированной ДНК в совокупности с изменениями в спектре молекул средней массы свидетельствуют о наибольшей активности патологического процесса на начальных этапах рассеянного склероза.
Рецензенты:
-
Мирютова Н.Ф., д.м.н., профессор, руководитель неврологического отделения ФГБУ «Томский научно-исследовательский институт курортологии и физиотерапии Федерального медико-биологического агентства», г. Томск;
-
Куликова Н.В., д.м.н., профессор кафедры безопасности жизнедеятельности ФГБОУ ВПО «Томский государственный педагогический университет Министерства образования и науки РФ», г. Томск.
Работа поступила в редакцию 06.04.2012.