В настоящее время комплексное лечение сепсиса и септического шока включает методы экстракорпоральной детоксикации, и, в частности, гемо- и лимфосорбции [5]. Процедура гемосорбции не только способствует улучшению реологических свойств крови, но и значительно снижает содержание в системном кровотоке триггеров и медиаторов воспаления (бактериальные эндо- и экзотоксины, цитокины) [6]. В качестве неселективных гемосорбентов в медицине широко применяется активированный уголь. Однако показатели биосовместимости этого вида материалов не являются оптимальными: при контакте гранул активированных углей с клетками крови отмечаются гемолиз эритроцитов и активная агрегация тромбоцитов [8]. Современные достижения в области разработки новых материалов с использованием нанотехнологий расширили спектр потенциально перспективных гемосорбентов. В частности, по-мнению ряда специалистов, чрезвычайно перспективными материалами для использования в качестве сорбентов в медицинской практике являются ферримагнитные частицы. Так было установлено, что наночастицы Fe2O3 и CoFe2O4 способны эффективно сорбировать антигены и вирусы [3]. Также имеются сообщения о перспективности применения в медицине нанодисперсного магнетита (Fe3O4) [4,7]. Суммарная площадь сорбционной поверхности магнетита составляет от 800 до 1200 м2/г, а напряженность магнитного поля, которое индуцируется каждой частицей, достигает 300-400 кА/м [1]. Однако в литературе имеются сведения о негативном влиянии ферримагнитных наночастиц на клетки крови, что может лимитировать применение этого в качестве гемосорбентов [9]. Кроме того, практически отсутствуют сведения о способности ферримагнитных наночастиц элиминировать триггеры и медиаторы воспаления из крови и других биологических жидкостей.
Цель исследования: изучить элиминацию цитокинов наночастицами на основе Fe3O4 и Fe2O3, а также оценить их токсичность при контакте с клетками крови.
Материалы и методы исследования
Исследуемые наночастицы: Fe3О4, чист. 98 %; Fe3О4, модифицированный углеродом, чист. 98 %; Fe3О4, модифицированный серебром (1 %), чист. 99 %; Fe2О3, порошок чист. 99 %. Размер частиц в указанных образцах - 20-100 нм. Подготовка образцов сорбентов к исследованию включала 3-кратную промывку спиртом, а затем физиологическим раствором хлорида натрия.
Оценка связывания цитокинов. Исследуемые наночастицы (1,6 ± 0,14 г), вносили в физиологический раствор хлорида натрия (5 мл), содержащий рекомбинантные цитокины человека фактор некроза опухолей α TNFα (Biosourse), интерлейкин-6 (IL-6) (Miltenyi Biotec), интерлейкин-1 β IL-1β (Sigma), интерлейкин-10 IL-10 (Biosourse) и инкубировали на шейкере орбитальном шейкере OS-10, Latvia (350 rpm) при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем частицы удаляли с помощью магнитного концентратора частиц Dynal MPC-L и оценивали с помощью иммуноферментного анализа концентрацию цитокинов, оставшихся в растворе. Полученные результаты сравнивали с показателями интактного контроля (суспензия цитокинов, в которую не вносили наночастицы). Все образцы супернатанта до исследования хранили при -60 °С. Концентрацию цитокинов определяли с использованием коммерческих наборов на основе твердофазного сэндвич- ELISA (a solid phase sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Вектор Бест, РФ; в соответствии с инструкциями производителей. Показатель элиминации цитокинов в результате адсорбции рассчитывали как отношение концентрации цитокина в образце после адсорбции и интактного контроля, выраженное в %.
Исследование уровня клеточного метаболизма мононуклеарных лейкоцитов (МЛ). Суспензию МЛ в среде RPMI-1640 ПанЭко, РФ в концентрации 4,5×105 кл/мл ± 10,1 %, выделенных из венозной крови здорового донора, стабилизированной цитратом натрия, на градиенте плотности фиколл-урографин и трижды отмытых при центрифугировании средой RPMI-1640 или раствором Хенкса, коинкубировали с навесками наночастиц в течение 1 часа в термостатируемом дигитальном шейкере ST-3L, РФ при 37 °С и 200 об/мин. Затем сорбенты удаляли магнитным концентратором. Суспензию МЛ пассировали в плоскодонные лунки 96-луночных микропланшетов Costar по 200 мкл. Физиологическую активность клеток исследовали в МТТ-тесте [2].
Для расчета показателя токсического воздействия сорбентов на клетки, отражающего относительное количество погибших клеток в суспензии, использовали следующую формулу:
Цитотоксичность, % = (1 - ОПпас/ОПк)∙100, (1)
где ОПпас - оптическая плотность в лунке после адсорбции, ОПк - оптическая плотность в лунке с интактным контролем.
Показатель элиминации цитокинов в результате адсорбции рассчитывали как отношение концентрации цитокина в образце после адсорбции к показателю в интактном контроле, выраженное в %.
Статистический анализ проводился с использованием методов непараметрического анализа пакета прикладных программ Statistica for Windows 6.0 «StatSoft Inc». Межгрупповое множественное сравнение показателей осуществляли с использованием критерия Крускалла-Уоллиса, а попарное сравнение с интактным контролем - при помощи критерия Даннета. Различия между группами считались статистически значимыми при р < 0,05. Данные представлены в виде медианы, минимального и максимального значений.
Результаты исследования и их обсуждение
Элиминация цитокинов
Результаты, представленные на рис. 1, свидетельствуют, что все 4 образца эффективно (91-100 %) элиминировали из физиологического раствора TNFα и IL-1β -после удаления сорбентов в растворе определялись только следовые концентрации (менее 4 пг/мл) этих цитокинов. Аналогично, все исследуемые сорбенты способны связывать IL-10, однако статистически значимый эффект был отмечен только после инкубации с Fe3O4 (на 40 %), Fe3O4 + С (на 37 %) и Fe2O3 (на 96 %). Уровень IL-6 достоверно снижался только после инкубации с Fe3O4 + Ag (на 97 %) и Fe2O3 (на 76 %), однако заметна также статистически не подтвержденная (p > 0,05) тенденция к снижению этого цитокина после коинкубации с Fe3O4 (на 36 %) и Fe3O4 + С (на 40 %).
В целом, из исследованных образцов сорбентов наиболее эффективно элиминировали рекомбинантные цитокины человека Fe2O3 и чистый магнетит (Fe3О4) .
Гемосовместимость ферримагнитных наночастиц
Тестирование исследуемых частиц на гемосовместимость осуществляли, оценивая изменение митохондриальной активности лейкоцитов крови человека после коинкубации с сорбентами относительно показателей интактного контроля клеточной суспензии.
Представленные на рис. 2 данные свидетельствуют о том, что образцы магнетита с модифированной поверхностью Fe3O4 + С и Fe3O4 + Ag оказывали более выраженный цитотоксический эффект (49 и 84 % соответственно) в сравнении с образцами из чистого оксида железа Fe3O4 и Fe2O3. При этом магнетит обладал наименьшей токсичностью (17 %), тогда как Fe2O3 вызывал гибель 24 % клеток.
Результаты исследований свойств ферримагнитных наночастиц, приведенные в данной работе, свидетельствуют о том, что рассматриваемые наночастицы эффективно элиминируют широкий спектр биологически активных молекул (цитокины, бактериальные экзо-и эндотоксины). Вместе с тем эти материалы обладают высокой цитотоксичностью по отношению к клеткам крови, что существенно ограничивает возможность их применения для гемосорбции, предполагающей непосредственный контакт наночастиц с клетками крови. Однако указанный материал может рассматриваться как чрезвычайно перспективный для детоксикации бесклеточных физиологических жидкостей, таких как лимфа или плазма крови. Кроме того, проблему улучшения гемосовместимости в значительной степени можно разрешить созданием нанокомпозитных материалов, где полимерная гемосовместимая матрица экранирует поверхность неорганического компонента.
Рис. 1. Концентрация рекомбинантных цитокинов человека в 0,9 %-м растворе хлорида натрия после инкубации с ферримагнитными наносорбентами
* - достоверное отличие от интактного контроля (р < 0,05)
Рис. 2. Гибель МЛ крови человека
после коинкубации с ферримагнитными наночастицами
Рецензенты:
Грубер И.М., д.м.н., профессор, руководитель лаборатории НИИВС им. Мечникова РАМН, г. Москва;
Аминат Р.Т., д.м.н., профессор, зав. лабораторией иммунологии ГОУ ВПО «Адыгейский государственный университет» г. Майкоп.
Работа поступила в редакцию 21.09.2011.