Из-за преимущественно хронического течения и склонности к неуклонному прогрессированию ревматические заболевания находятся на одном из первых мест среди причин ухудшения качества жизни, а также временной и стойкой нетрудоспособности, являясь тяжелым бременем, как для пациента, так и для всей системы здравоохранения [3]. В связи с этим наиболее актуальной становится проблема ранней диагностики начальных проявлений активации и прогрессирования патологического процесса у ревматических больных.
Целью работы явилась разработка дополнительных критериев иммунодиагностики ревматоидного артрита (РА), системной красной волчанки (СКВ) и системной склеродермии (ССД) с использованием иммобилизированных антигенных наносистем (АНС) на основе супероксиддисмутазы (СОД), церулоплазмина (ЦП), ксантиноксидазы (КО) и каталазы (КАТ).
Материалы и методы исследования
Исследовалась сыворотка крови 30 практически здоровых лиц - доноров станции переливания крови (группа контроля), а также 86 больных РА, 46 больных СКВ и 40 больных ССД. Диагноз РА и СКВ ставился на основании критериев Американского колледжа ревматологов 1987 г. и 1982 г. соответственно. Диагностика ССД, определение степени активности, характера течения и стадии заболевания проводились в соответствии с критериями АРА и отечественной классификацией (Н. Гусева, 1975).
Объектом исследований служила сыворотка крови. Ферментативную активность ЦП определяли по методике Ravin в модификации Тена (1981); активность плазменной СОД - по методу Дубининой Е.Е. и соавт. (1986); активность КО - по модифицированной методике Калькара (Дячина Е.Г., 1973); активность КАТ - по методу Королюк М.А. и соавт. (1988).
Антитела (АТ) к СОД, ЦП, КО и КАТ выявляли твердофазным иммуноферментным анализом в модификации Гонтаря И.П. и соавт. с использованием АНС, для получения которых применяли метод эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота с включением магнитного материала и соответствующей антигенной матрицы [2].
Результаты исследования и их обсуждение
Предварительно нами были определены условия получения АНС:
1) АНС создавались на основе 20 %-го полиакриламидного геля и представляли собой гранулы сферической формы размером 10-100 мкм;
2) антигенную матрицу АНС формировали, используя водные растворы антигенов: оптимальная концентрация для СОД составила 1,4 мг/мл, для ЦП - 0,75 ммоль/л, для КО - 50 мкг/мл, для КАТ - 1,4 мкг/мл;
3) изучение влияния времени хранения на АНС с белковой матрицей показало, что максимальное количество белка удаляется из полиакриламидных гранул на 2-3 сутки хранения, а затем процесс резко замедляется; общее количество антигена, оставшееся в гранулах после 6 суток хранения, составило в среднем 96,8 %, после 30 суток - 96,8 %;
4) потери иммобилизированного антигена из АНС изучали при температуре +4, 20 и 37 °С; реальные потери белка при максимальной температуре составили 0,093 %. По-видимому, на поверхности гранул АНС имеются молекулы антигена, частично включенные в пространственную решетку геля, а при хранении и воздействии разных температур полиакриламидный гель несколько набухает, что и приводит к потерям белка.
При исследовании сывороток крови здоровых лиц на содержание антител к ферментам антиоксидантной системы организма с помощью иммуноферментного метода на основе АНС были получены следующие результаты: уровень АТ к СОД (M ± m) составил 0,06 ± 0,004 е.о.п., АТ к ЦП - 0,022 ± 0,003 е.о.п., АТ к КО - 0,032 ± 0,002 е.о.п. и АТ к КАТ - 0,067 ± 0,004 е.о.п. Ферментативная активность СОД в контрольной группе составила 40 ± 2,5 ед., ЦП - 1,087 ± 0,249 ед., КО - 3,67 ± 0,12 ед., КАТ - 22,6 ± 1,6 ед.
Ревматоидный артрит
При РА наблюдалось повышение ферментативной активности ЦП и КО (p = 0,035), снижение активности СОД и КАТ (p = 0,008). АТ к ЦП выявлены у 59,3 % больных РА, АТ к КО - у 47,7 % больных, АТ к СОД - у 65,1 % больных и АТ к КАТ - у 61,6 % больных РА.
У больных с I степенью активности РА при поступлении на стационарное лечение отмечалось повышение активности СОД (р = 0,12), ЦП (р = 0,007), КО (р < 0,001) и уменьшение активности КАТ (p = 0,004), а также увеличение содержания АТ к ЦП (р = 0,009), КАТ (p = 0,028) и СОД (р = 0,24). У больных РА со II степенью активности патологического процесса отмечено снижение активности СОД и КАТ (p = 0,039 и р = 0,042, соответственно) и увеличение содержания АТ к ним (p = 0,008 и р = 0,025 соответственно). Содержание АТ к ЦП и КО было в 1,5-2 раза выше уровня АТ при минимальной активности патологического процесса (р = 0,042), ферментативная активность ЦП (р > 0,05) и КО (p = 0,007) также возрастала. При III степени активности заболевания по сравнению с показателями больных РА с активностью II наблюдалось увеличение содержания АТ к СОД (p = 0,009), КО и КАТ (p > 0,05) и незначительное снижение уровня АТ к ЦП (р > 0,05), на фоне повышения активности ЦП (p = 0,004), СОД (p > 0,05) и уменьшения активности КАТ (p = 0,006) (табл. 1).
В результате проведенного в условиях стационара лечения у больных РА отмечалось повышение активности СОД (p = 0,029), КАТ (p = 0,025), снижение активности ЦП (р > 0,05), КО (p = 0,008) и уменьшение уровня антител к СОД (p = 0,033), КО (p = 0,007), ЦП и КАТ (р > 0,05).
Таблица 1
Показатели содержания антител к СОД, ЦП, КО, КАТ в зависимости
от активности патологического процесса (М ± SD)
|
Контингент |
N |
Антитела к СОД |
Антитела к ЦП |
Антитела к КО |
Антитела к КАТ |
|
Здоровые |
30 |
0,06 ± 0,022 |
0,022 ± 0,014 |
0,032 ± 0,013 |
0,067 ± 0,019 |
|
Активность ревматоидного артрита |
|||||
|
I степень |
16 |
0,078 ± 0,018 |
0,094 ± 0,052 |
0,054 ± 0,029 |
0,089 ± 0,034 |
|
II степень |
62 |
0,144 ± 0,049 |
0,162 ± 0,054 |
0,112 ± 0,044 |
0,119 ± 0,048 |
|
III степень |
8 |
0,207 ± 0,022 |
0,149 ± 0,063 |
0,211 ± 0,019 |
0,141 ± 0,076 |
|
Активность системной красной волчанки |
|||||
|
Минимальная |
16 |
0,062 ± 0,021 |
0,088 ± 0,039 |
0,067 ± 0,034 |
0,092 ± 0,037 |
|
Умеренная |
27 |
0,161 ± 0,034 |
0,133 ± 0,056 |
0,099 ± 0,046 |
0,142 ± 0,045 |
|
Высокая |
3 |
0,219 ± 0,048 |
0,157 ± 0,060 |
0,197 ± 0,039 |
0,212 ± 0,067 |
|
Активность системной склеродермии |
|||||
|
Минимальная |
16 |
0,045 ± 0,027 |
0,061 ± 0,023 |
0,037 ± 0,019 |
0,071 ± 0,032 |
|
Умеренная |
24 |
0,126 ± 0,033 |
0,084 ± 0,026 |
0,062 ± 0,022 |
0,099 ± 0,018 |
Примечание: N - количество больных, SD - стандартное отклонение.
РА нередко сопровождается анемией, которая коррелирует не столько с длительностью болезни, сколько со степенью ее клинической активности (лихорадкой, количеством пораженных суставов, интенсивностью синовитов и другими проявлениями). Все больные РА были разделены в зависимости от уровня гемоглобина и количества эритроцитов на три группы: I группа - без анемии (57 человек); II группа - с анемией, 90 г/л < Hb < 115 г/л (19 человек); III группа - с выраженной анемией, Hb < 90 г/л (12 человек) (табл. 2).
Таблица 2
Уровни антител к СОД, КАТ и ЦП у больных РА с различным содержанием гемоглобина
|
Контингент обследуемых |
N |
Антитела к СОД, M (SD) |
Антитела к КАТ, M (SD) |
Антитела к ЦП, M (SD) |
|
Здоровые |
30 |
0,060 (0,022) |
0,067 (0,019) |
0,022 (0,014) |
|
Больные РА без анемии |
57 |
0,112 (0,044) |
0,103 (0,033) |
0,120 (0,040) |
|
Больные с 90 г/л < Hb < 115 г/л |
19 |
0,153 (0,037) |
0,136 (0,029) |
0,158 (0,013) |
|
Больные с Hb < 90 г/л |
12 |
0,178 (0,028) |
0,157 (0,014) |
0,170 (0,025) |
Примечание: N - количество больных, SD - стандартное отклонение.
При поступлении в стационар у 31 (36 %) человека диагностированы явления анемии различной степени. Эта группа больных имела достоверные различия в содержании АТ к СОД, КАТ и ЦП по сравнению с пациентами без анемии (p < 0,001). В содержании АТ к КО у больных РА с различным уровнем гемоглобина различий не выявлено (р > 0,05).
Учитывая, что иммунологические изменения, происходящие в организме, тесно связаны с биохимическим процессами, было проведено изучение влияния выраженности антителогенеза к изучаемым ферментам на активность СОД, КАТ и ЦП у больных РА с различным уровнем гемоглобина. Ферментативная активность СОД была существенно снижена в III группе и достоверно отличалась от показателей больных РА с уровнем Hb < 115 г/л и > 90 г/л (II группа) (р = 0,0002). Статистически значимых различий между I и II группой в определении активности СОД выявлено не было (р = 0,320) (в I группе активность СОД - 4,76 ± 1,71, во II группе - 4,44 ± 1,79 и в III группе - 2,83 ± 1,12).
Также было отмечено угнетение ферментативной активности каталазы практически у всех больных РА, причем с нарастанием явлений анемии снижение активности фермента более выражено (в I группе активность КАТ - 9,62 ± 2,71, во II группе - 6,47 ± 1,78 и в III группе - 4,51 ± 0,96).
Известная стимулирующая роль ЦП на кроветворение подтолкнула нас к изучению зависимости между интенсивностью антителогенеза, содержанием ЦП с одной стороны, и выраженностью анемии - с другой. У больных I и II групп найдены достоверные отличия по уровню АТ к ЦП (p = 0,006), содержанию ферментативно-активного (1021 ± 329 и 1198 ± 499, p = 0,013) и иммунореактивного ЦП (1405 ± 492 и 1640 ± 704, p = 0,023). Изучаемые показатели в III группе были выше, чем во второй, но эти различия недостоверны (p > 0,05).
Таким образом, более высокий уровень антител к ферментам АОС наблюдается у больных с наличием внесуставных проявлений, особенно при развитии анемии, свидетельствуя о тяжести заболевания.
Системная красная волчанка
При СКВ имело место повышение ферментативной активности ЦП (менее выраженное, чем при РА, p = 0,048), снижение активности КАТ (p = 0,009), отмечена тенденция к росту активности КО (р > 0,05). Антитела к ЦП выявлены у 48 % больных СКВ, антитела к КАТ - у 52,2 % больных, АТ к СОД - у 39,9 % больных и АТ к КО - у 41,3 % больных. Следует отметить, что динамика показателей ферментативной активности и уровней антител к изучаемым энзимам у больных СКВ в зависимости от активности патологического процесса имела схожие черты с процессами, наблюдаемыми при РА (снижение активности СОД, p = 0,028 и КАТ, p = 0,019; на фоне роста уровня АТ к данным ферментам, p < 0,001) (см. табл. 1).
Однако имелись и особенности, так, например, в группе больных СКВ с наличием АТ к ЦП активность ЦП была существенно ниже, чем у больных без данных антител (p < 0,001). Интересные результаты были получены в ходе динамического наблюдения за больными. При выписке из стационара отмечалось некоторое снижение активности ЦП в группе больных без антител к ЦП. Однако в группе больных с наличием антител к ферменту активность ЦП не только не снижалась, а повышалась (p = 0,037). Уровень АТ к ЦП на фоне лечения имел тенденцию к снижению (р > 0,05). В группе больных СКВ с наличием АТ к КО отмечено увеличение активности фермента в сыворотке крови (p = 0,041), причем стандартная терапия оказывала слабое воздействие на нормализацию иммуно-биохимических сдвигов.
Системная склеродермия
Фиброзирование и нарушение микроциркуляции, приводящие к развитию ишемии и кардиосклероза, являются основой развития одного из ведущих висцеральных проявлений при ССД - поражения сердца. У 21 (52,5 %) больного ССД отмечалось поражение сердца.
Для раннего выявления сердечно-сосудистых осложнений при ССД наиболее эффективным оказалось определение антител к СОД. Данные антитела выявлялись в 40 % случаев. При минимальной степени активности патологического процесса (16 человек) высокие уровни АТ к СОД были выявлены у 6 (37,5 %) больных. С увеличением степени активности заболевания достоверные изменения отмечены при определении уровня АТ к СОД (р < 0,001) (табл.1). У больных ССД с поражением сердечно-сосудистой системы отмечены наиболее высокие уровни антител к СОД (c2 = 4,58; р = 0,032) и каталазе (c2 = 3,57; р = 0,048).
Больным ССД была проведена капилляроскопия сосудов ногтевого ложа, по результатам которой были выявлены характерные изменения: у 22 пациентов (55 %) - значительные нарушения (уменьшение количества капилляров, их деформация, наличие нескольких аваскулярных зон), у 10 (25 %) умеренные, у 8 (10 %) - невыраженные. Кроме того, все больные с высоким содержанием антител к СОД имели высокую (II-IV) степень синдрома Рейно, сопровождающегося выраженной ишемией и, следовательно, гипоксией тканей, в результате чего отмечается усиление пероксидации мембранных структур и апоптоза клеток [1].
Таким образом, иммунные механизмы оказывают существенное влияние на выраженность реакций свободнорадикального окисления при ревматических заболеваниях. Активные формы кислорода могут оказывать патогенное воздействие на биомолекулы и структуры клетки непосредственно, либо инициируя процессы перекисного окисления липидов, приводя к повреждению белков, липидов, нуклеиновых кислот и придавая им свойства аутоантигенов. Образование аутоантител к таким структурам является ключевым звеном патогенеза системных ревматических заболеваний и происходит задолго до развития выраженных клинических проявлений [4, 5].
Выводы
Показатели ферментативной активности и содержания антител к ферментам-прооксидантам (КО) и ферментам антиоксидантной защиты организма (ЦП, СОД и КАТ) могут использоваться в диагностике ранних клинических проявлений РА, СКВ и ССД, а также в качестве дополнительного критерия оценки эффективности проводимой терапии.
Рецензенты:
Краюшкин С.И., д.м.н., профессор, зав. кафедрой амбулаторной и скорой медицинской помощи ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздравразвития, г. Волгоград;
Борис Ф.Н., д.м.н., профессор, зав. кафедрой госпитальной терапии ВБОУ ВПО «Кировская ГМА» Минздравсоцразвития России, г. Киров.
Работа поступила в редакцию 29.09.2011.