Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,674

Personal portfolio

THE ABILITY OF LACHRYMAL FLUID TO REDUCE THE ACTIVE FORMS OF OXYGEN IN THE ACUTE PHASE OF ADENOVIRAL KERATOCONJUNCTIVITIS

Bykova E.V. 1 Storozhuk L.A. 1 Khvostova T.S. 1
1 State Educational Institution of Higher Professional Education «Kuban State Medical University» of Ministry of Public Health and Social Development of Russian Federation, Krasnodar
The work depicts the luminol-chemiluminescent (L-CHL) method of estimation the ability of lachrymal fluid (LF) to reduce the active forms of oxygen (AFO) that was used in the analysis of this LF property among healthy people (control) and those who suffered from adenoviral keratoconjunctivitis (AVCC). It was found that the ability of LF to reduce AFO of those who suffered from AVCC increased more than two-fold (+127 %) and it was observed on the background of epiphora (increased lacrimation).
lacrymal fluid
luminol-chemiluminesce
active forms of oxygen
adenoviral keratoconjunctivitis
В офтальмологической практике для определения степени тяжести заболевания органов зрения и эффективности их терапии часто прибегают к различным биохимическим методам исследования слезной жидкости (СЖ). Среди них видное место занимает определение её способности гасить агрессивные формы кислорода (АФК) такие, как ´O2, О2-, -ОН и Н^, избыточно образующиеся при воспалительных заболеваниях, например, при аденовирусном кератоконъюнктивите (АВКК), офтальмогерпесе и др. Для этих целей используется люминол-хемилюминисценция в буферном растворе, индуцированная Н2О2, которая гасится компонентами антирадикальной защиты (АРЗ) биологической жидкости (белками, мочевой кислотой, билирубином и другими соединениями органической природы [1, 2, 4].

Для люминол-хемилюминисцентного (л-ХЛ) метода определения способности СЖ гасить АФК используется люминотестор - ЛТ-01 при X = 335 нм (Ростовского НИИ экспериментальной биологии), электронное устройство которого рассчитано на 10 условных единиц.

В настоящее время не существует унифицированного метода для определения способности гасить активные формы кислорода (ГАФК) в биологических жидкостях. Обычно л-ХЛ биологической жидкости определяют в Трис-НС1 буфере, которую индуцируют раствором Н2О2. Объемы буферного раствора (содержащего люминол) и Н2О2 подобраны таким образом, чтобы при их соединении максимальная вспышка л-ХЛ равнялась 10,0 ± 0,2 усл. ед., которая принимается за 100 %. Поскольку этот тест является ценным показателем остроты заболевания и его ремиссии, на примере СЖ мы подробно описываем этот метод [3].

Материалы и метод исследования

В качестве объекта исследования служила слезная жидкость (СЖ), полученная у 15 здоровых взрослых людей обоего пола (контроль) и у 25 больных в острый период аденовирусного кератоконъюнктиви- та. СЖ собирали при помощи специальной пипетки со съемными наконечниками в полиэтиленовые эпиндорфы (на 2 мл), которую сразу же подвергали исследованию, а если не удавалось сделать анализ в день взятия пробы, то её хранили в замороженном виде в рефрижераторе при Т = 20 °С.

Реактивы

  1. Приготовление Трис-НС1 буфера рН 6,8, 0,1 М. Трис(гидроксиметил) аминометан (С4НО3К) 6,06 г растворяют в 450 мл дистиллированной Н2О, добавляют 4,6 мл концентрированной НС1, подгоняют рН до 6,8 и доводят объем раствора до 500 мл. Если используется С4H11O3, то берут 7,85 г /0,5 л Н2О.
  2. Приготовление раствора люминола. Люминола 4,5 мг растворяют в 10 мл Трис-НС1 буфера с рН 6,8 в пробирке, помещенной в водяную баню при Т 70-80°С.
  3. Приготовление 0,35Мраствора Н2О2. Пергидроля 4,2 мл растворяют Н2О в колбе на 100 мл и доводят до метки.
  4. Приготовление рабочего раствора люминол-буферной смеси. 2 мл раствора люминола (по п. 2) растворяют в 100 мл буфера (по п. 1).

Ход анализа

  1. в пробирку вносят 2,9 мл люминол-буферной смеси (по п.4);
  2. туда же вносят 10 мкл слезной жидкости;
  3. прогревают в водяном термостате 8 мин при - 35-37 °С;
  4. реакционную смесь переносят из пробирки в кювету (с толщиной слоя жидкости 10 мм);
  5. кювету ставят в гнездо ЛТ-01;
  6. через инжектор в кювету вносят 0,5 мл раствора Н2О2 (по п. 3);
  7. записывают результаты, высвечиваемые на табло прибора;
  8. рассчитывают % гашения и количество единиц гасящих факторов.

Результаты исследования и их обсуждение

Поскольку СЖ можно получить ограниченное количество (не более 0,1-0,3 мл) и она обладает очень высокой активностью ГАФК, то мы её разводили в Трис-НС1 буфере с рН 6,8 (1:10), а в опыт вносили со 100 мкл раствора СЖ или 10 мкл натуральной СЖ.

После введения такого количества СЖ в люминол-буферный раствор и прогревания в термостате удалось установить, что в СЖ лиц контрольной группы не погашенных активных (агрессивных) форм кислорода было от 3,68 до 8,9 (в среднем 6,12 ± 0,48) усл. ед., по сравнению с холостой пробой (10,02 ± 0,05 ед.), принимавшейся за 100 %. В то время, как у больных в острый период аденовирусного кератоконъюнктивита эти показатели в СЖ колебались от 0,58,5 до 2,59 (в среднем было 1,18 ± 0,12) усл. ед. Для расчета активности показателя в единицах компонентов антирадикальной защиты (АРЗ) слезной жидкости, способных гасить л-ЛХ в описанных условиях, пользуются формулой:

Х = (К - О)-100 усл. ед./мл,

где Х - АРЗ СЖ по способности гасить л-ХЛ; К - контроль (по холостой пробе = 10,0); О - опыт (количество усл.ед. непогашенной л-ХЛ); 100 - коэффициент пересчета усл. ед на 1 мл СЖ.

В качестве примера приводим расчеты антирадикальной защиты (количество погашенных усл.ед./мл) слезной жидкости Х1 - здоровых людей (контроль), и Х2 - больных в острую фазу АВКК.

Х1 = (10,0 - 6,12)-100 = 388 ед./мл (100 %);

Х2 = (10,0 - 1,18)*100 = 882 ед./мл (227 %).

Для сравнения данные Х1 мы взяли за 100 %. Из этих расчетов видно, что у больных в острую фазу АВКК активность антирадикальной защиты СЖ увеличивается более чем в два раза (+127 %). Кроме того, необходимо учесть, что если настоящее заболевание в острую фазу сопровождается повышенным слезотечением, то образование факторов АРЗ следует увеличить еще в несколько раз.

Итак, в связи с этим следует отметить, что аденовирус, поднимаясь из носоглотки по слезовыводящим путям вверх и вовлекая в патологический процесс слизистые оболочки мягких тканей глаза, индуцирует биосинтез факторов антирадикальной защиты СЖ, которые направлены на снижение количества избыточно образующихся агрессивных форм кислорода. Хотя активные формы кислорода также являются факторами защиты организма.

Рецензенты:

  • Голубцов В.И., д.м.н., профессор, зав. кафедрой биологии с курсом медицинской генетики ГОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Краснодар;
  • Каде А.Х., д.м.н., профессор, зав. кафедрой общей и клинической патологической физиологии ГОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Краснодар.

Работа поступила в редакцию 26.05.2011.