Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Быкова Е.В. 1 Сторожук Л.А. 1 Хвостова Т.С. 1

---

1 ГОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет», Краснодар

Описан люминол-хемилюминисцентный (л-ХЛ) метод определения способности слезной жидкости (СЖ) гасить активные формы кислорода (АФК), который использован при изучении этого свойства в СЖ у здоровых людей (контроль) и страдающих аденовирусным кератоконъюнктивитом (АВКК). Установлено, что у больных в острую фазу АВКК свойство СЖ гасить АФК (антирадикальной защиты) увеличивается более чем в два раза (+127 %), которое отмечено на фоне повышенного слезотечения.

Статья в формате PDF

321 KB

слезная жидкость

люминол-хемилюминисценция

активные формы кислорода

аденовирусный кератоконъюнктивит

1. Биохимические методы исследования слезной жидкости при вирусном кератоконъюнктивите / Е.В. Быкова, Е.Е. Соголовская, Т.С. Хвостова, Л. А. Сторожук // Актуальные проблемы офтальмологии: Всероссийская науч. конф. молодых ученых: Сборник научных работ. - М., 2010. - С. 43-45.

2. Сторожук П.Г. Цыганков А.И. Состояние системы антирадикальной защиты крови у больных с доброкачественной гиперплазией предстательной железы в до- и после операционном периодах // Вестник интенсивной терапии. - 2007. - №5. - С. 213-215.

3. Хемилюминисценция и нитраты ротовой жидкости при использовании конструкций, корректирующих прикус зубов / П. Г. Сторожук, В. А. Артамонов, М. В. Артамонов, И.А. Сторожук // Вестник интенсивной терапии. - 2005. - №5. - С. 237-239.

4. Состояние антиоксидантной системы крови у женщин в до- и послеродовом периодах и при кесаревом сечении / П.Г. Сторожук, Б.Г. Ермошенко, И.М. Быков, А.П. Сторожук, А. И. Лузум // Intern. J. on Immunorehabilita- tion. - 2002. - Том. 4, № 2. - С. 234-240.

Для люминол-хемилюминисцентного (л-ХЛ) метода определения способности СЖ гасить АФК используется люминотестор - ЛТ-01 при X = 335 нм (Ростовского НИИ экспериментальной биологии), электронное устройство которого рассчитано на 10 условных единиц.

В настоящее время не существует унифицированного метода для определения способности гасить активные формы кислорода (ГАФК) в биологических жидкостях. Обычно л-ХЛ биологической жидкости определяют в Трис-НС1 буфере, которую индуцируют раствором Н₂О₂. Объемы буферного раствора (содержащего люминол) и Н₂О₂ подобраны таким образом, чтобы при их соединении максимальная вспышка л-ХЛ равнялась 10,0 ± 0,2 усл. ед., которая принимается за 100 %. Поскольку этот тест является ценным показателем остроты заболевания и его ремиссии, на примере СЖ мы подробно описываем этот метод [3].

Материалы и метод исследования

В качестве объекта исследования служила слезная жидкость (СЖ), полученная у 15 здоровых взрослых людей обоего пола (контроль) и у 25 больных в острый период аденовирусного кератоконъюнктиви- та. СЖ собирали при помощи специальной пипетки со съемными наконечниками в полиэтиленовые эпиндорфы (на 2 мл), которую сразу же подвергали исследованию, а если не удавалось сделать анализ в день взятия пробы, то её хранили в замороженном виде в рефрижераторе при Т = 20 °С.

Реактивы

1. Приготовление Трис-НС1 буфера рН 6,8, 0,1 М. Трис(гидроксиметил) аминометан (С₄НО₃К) 6,06 г растворяют в 450 мл дистиллированной Н₂О, добавляют 4,6 мл концентрированной НС1, подгоняют рН до 6,8 и доводят объем раствора до 500 мл. Если используется С4H11O3, то берут 7,85 г /0,5 л Н₂О.
2. Приготовление раствора люминола. Люминола 4,5 мг растворяют в 10 мл Трис-НС1 буфера с рН 6,8 в пробирке, помещенной в водяную баню при Т 70-80°С.
3. Приготовление 0,35Мраствора Н₂О₂. Пергидроля 4,2 мл растворяют Н₂О в колбе на 100 мл и доводят до метки.
4. Приготовление рабочего раствора люминол-буферной смеси. 2 мл раствора люминола (по п. 2) растворяют в 100 мл буфера (по п. 1).

Ход анализа

1. в пробирку вносят 2,9 мл люминол-буферной смеси (по п.4);
2. туда же вносят 10 мкл слезной жидкости;
3. прогревают в водяном термостате 8 мин при - 35-37 °С;
4. реакционную смесь переносят из пробирки в кювету (с толщиной слоя жидкости 10 мм);
5. кювету ставят в гнездо ЛТ-01;
6. через инжектор в кювету вносят 0,5 мл раствора Н₂О₂ (по п. 3);
7. записывают результаты, высвечиваемые на табло прибора;
8. рассчитывают % гашения и количество единиц гасящих факторов.

Результаты исследования и их обсуждение

Поскольку СЖ можно получить ограниченное количество (не более 0,1-0,3 мл) и она обладает очень высокой активностью ГАФК, то мы её разводили в Трис-НС1 буфере с рН 6,8 (1:10), а в опыт вносили со 100 мкл раствора СЖ или 10 мкл натуральной СЖ.

После введения такого количества СЖ в люминол-буферный раствор и прогревания в термостате удалось установить, что в СЖ лиц контрольной группы не погашенных активных (агрессивных) форм кислорода было от 3,68 до 8,9 (в среднем 6,12 ± 0,48) усл. ед., по сравнению с холостой пробой (10,02 ± 0,05 ед.), принимавшейся за 100 %. В то время, как у больных в острый период аденовирусного кератоконъюнктивита эти показатели в СЖ колебались от 0,58,5 до 2,59 (в среднем было 1,18 ± 0,12) усл. ед. Для расчета активности показателя в единицах компонентов антирадикальной защиты (АРЗ) слезной жидкости, способных гасить л-ЛХ в описанных условиях, пользуются формулой:

Х = (К - О)-100 усл. ед./мл,

где Х - АРЗ СЖ по способности гасить л-ХЛ; К - контроль (по холостой пробе = 10,0); О - опыт (количество усл.ед. непогашенной л-ХЛ); 100 - коэффициент пересчета усл. ед на 1 мл СЖ.

В качестве примера приводим расчеты антирадикальной защиты (количество погашенных усл.ед./мл) слезной жидкости Х₁ - здоровых людей (контроль), и Х₂ - больных в острую фазу АВКК.

Х₁ = (10,0 - 6,12)-100 = 388 ед./мл (100 %);

Х₂ = (10,0 - 1,18)*100 = 882 ед./мл (227 %).

Для сравнения данные Х₁ мы взяли за 100 %. Из этих расчетов видно, что у больных в острую фазу АВКК активность антирадикальной защиты СЖ увеличивается более чем в два раза (+127 %). Кроме того, необходимо учесть, что если настоящее заболевание в острую фазу сопровождается повышенным слезотечением, то образование факторов АРЗ следует увеличить еще в несколько раз.

Итак, в связи с этим следует отметить, что аденовирус, поднимаясь из носоглотки по слезовыводящим путям вверх и вовлекая в патологический процесс слизистые оболочки мягких тканей глаза, индуцирует биосинтез факторов антирадикальной защиты СЖ, которые направлены на снижение количества избыточно образующихся агрессивных форм кислорода. Хотя активные формы кислорода также являются факторами защиты организма.

Рецензенты:

• Голубцов В.И., д.м.н., профессор, зав. кафедрой биологии с курсом медицинской генетики ГОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Краснодар;
• Каде А.Х., д.м.н., профессор, зав. кафедрой общей и клинической патологической физиологии ГОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Краснодар.

Работа поступила в редакцию 26.05.2011.

Библиографическая ссылка