Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) - заболевание лимфоидной ткани, характеризующееся клональной пролиферацией и неуклонным накоплением длительно живущих опухолевых лимфоцитов в периферической крови, костном мозге, лимфатических узлах, селезенке, печени и других органах и тканях. При этом злокачественные лимфоциты не способны выполнять свои иммунные функции. Распространенность ХЛЛ в настоящее время 3 на 100 тыс. населения, в 2004 году в США было выявлено 8190 новых случаев. Частота семейных случаев составляет не более 10 %. В последние годы был изучен ряд генов, продукты которых предположительно влияют на риск развития ХЛЛ, однако лишь для нескольких из них он был доказан [1].
В большинстве случаев диагноз ХЛЛ ставится уже на поздних стадиях болезни после присоединения осложнений. Между тем хорошо известно, что эффективность лечения ХЛЛ и качество жизни больных значительно повышаются при раннем назначении адекватной терапии. В связи с этим важной задачей онкогематологии является поиск прогностических критериев, позволяющих в наиболее ранние сроки оценить риск развития ХЛЛ [1, 5].
В регуляции процессов кроветворения принимает участие множество факторов роста, среди которых важным является основной фактор роста фибробластов - 2 bFGF (OMIM 134920). Белок bFGF представляет собой фактор широкого спектра действия, обладающий митогенной, ангиогенной и нейротрофической активностью. Он стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток путем активации серин/треониновой протеинкиназы raf1и опосредует организацию эндотелиальных клеток в капилляроподобные структуры. Белок bFGF играет важную роль в процессах быстрого увеличения количества бластных клеток, которые являются общим предшественником гематопоэтических и эндотелиальных клеток - гемангиобластов [2, 5, 7]. Кроме того, bFGF регулирует процессы кроветворения, управляя выживанием стволовых кроветворных клеток. Различные дефекты, связанные с подавлением функции bFGF, ведут к снижению выживания кроветворных клеток, а также нарушению процесса формирования их колоний [1]. Ген bFGF расположен в коротком плече и имеет 4 хромосомы (4q25-q27).
Целью настоящего исследования было изучение частот полиморфного варианта 773C > T гена bFGF у больных ХЛЛ и здоровых индивидов в Республике Башкортостан и поиск возможных ассоциаций генотипов и гаплотипов этих генов с развитием ХЛЛ.
Материалы и методы исследования
Молекулярно-генетическоий анализ образцов ДНК проведен у 224 человек - жителей Республики Башкортостан. В группу больных ХЛЛ вошли 123 пациента, находившиеся на стационарном лечении в гематологическом отделении Республиканской клинической больницы г. Уфы. Средний возраст обследованных пациентов, отобранных случайным образом, составил 49,6 ± 1,4 лет. На долю мужчин приходилось - 52,85 % (65 человек), женщин - 47,15 % (58 человек). По этнической принадлежности среди больных ХЛЛ оказалось 52 русских (42,28 %), 54 татар (43,90 %), 17 башкир (13,82 %). Клиническое обследование больных проводилось врачами больницы и включало в себя обязательные и дополнительные методы исследования.
В качестве контроля были использованы образцы ДНК 101 практически здорового индивида, отобранные с учетом возраста (47,3 ± 1,6), половой принадлежности (53 мужчины - 52,48 %, 48 женщин - 47,52 %) и этнического состава (43 русских - 42,57 %, 44 татар - 43,56 %, 14 башкир - 13,86 %).
Образцы ДНК были выделены из лимфоцитов периферической венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции [6].
Изучение полиморфных локусов проводилось методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК. Для генотипирования использовались локусспецифические олигонуклеотидные праймеры (F-5´-CAGGATTTGTGTGCTGTGG-3´, R-5´-GGTTCGAGAAGTTTTTGAAGA-3´) и эндонуклеаза рестрикции (BsuRI) [2].
Математическую обработку результатов исследования проводили на IBM-Pentium IV с использованием статистических программ BIOSTAT (Primer of Biostatistics, 4th Edition, S.A. Glantz, McGraw-Hill), а также в программах Statistica, Microsoft Excel.
Достоверность различий в распределении частот аллелей и генотипов между группами и ассоциацию с клиническим течением заболевания, выявляли, сравнивая выборки с использованием критерия χ2 с поправкой Иэйтса. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05. Относительный риск заболевания по конкретному признаку вычисляли как отношение шансов, доверительный интервал для относительного риска. Анализ выживаемости проводился по методу Каплан-Мейер [23].
Результаты исследования и их обсуждение
Распределение частот генотипов изученного гена bFGF в группах больных и здоровых индивидов соответствовало ожидаемому по равновесию Харди-Вайнберга.
При сравнении общей выборки больных ХЛЛ и группы контроля выявлены достоверные различия по частотам генотипов полиморфного локуса 773C > T гена bFGF (таблица).
Частоты генотипов и аллелей полиморфных локусов
в группах больных ХЛЛ и здоровых индивидов
|
Полиморфный вариант |
Генотипы, аллели |
Больные N = 123 |
Контроль N = 101 |
χ2 |
p |
OR |
95 % CI |
|
773C > T ген bFGF |
TT |
40,65 % |
56,44 % |
4,92 |
0,027 |
0,52 |
0,31-0,90 |
|
CT |
48,78 % |
36,63 % |
2,86 |
0,091 |
1,64 |
0,96-2,82 |
|
|
CC |
10,57 % |
6,93 % |
0,51 |
0,475 |
1,58 |
0,61-4,14 |
|
|
T |
65,00 % |
74,75 % |
4,48 |
0,035 |
0,62 |
0,41-0,94 |
|
|
C |
35,00 % |
25,25 % |
4,48 |
0,035 |
1,57 |
1,05-2,30 |
Примечание: жирным шрифтом выделены ячейки с достоверным уровнем значимости (p ≤ 0,05).
В группе больных ХЛЛ достоверно реже встречался генотип СС по сравнению с группой контроля (40,65 и 56,44 % соответственно, χ2 = 4,92; p = 0,027). Частота аллеля С полиморфного локуса 773C > T гена bFGF в группе больных ХЛЛ достоверно больше, чем в группе контроля (35,00 и 25,25 % соответственно, χ2 = 4,48; p = 0,035). Существенные различия также наблюдались по частотам аллеля Т (в контрольной группе - 74,75 % и в группе больных ХЛЛ - 65,00 % χ2 = 4,48; p = 0,035). По частотам генотипа ТТ достоверных различий не обнаружено.
При исследовании механизмов такого сложного многостадийного процесса, как опухоль, мутациям генов отводится большая роль. Хотя изменение отдельного онкогена может вызывать предрасположенность к раку, для того чтобы опухоль развилась, необходимы последующие мутации, затрагивающие другие онкогены, в частности, гены-суппрессоры опухолей или гены, контролирующие программируемую клеточную смерть. Каждый из генов, принадлежащих к этим трем категориям, выполняет свою роль по разным механизмам. Вопрос в том, как они взаимодействуют в многоступенчатом процессе, приводящем, в конечном счете, к возникновению раковой клетки, и какова их роль в нормальных процессах жизнедеятельности.
В то время как значимость для гематопоэза микросреды костного мозга давно доказана [7], роль, которую играют клетки эндотелия и ангиогенные факторы в образовании гематологических опухолей, стала очевидной лишь в последнее время [4]. Одновременная экспрессия bFGF и его рецепторов была установлена в миелобластах и незрелых миелоидных элементах при остром миелоидном лейкозе, множественной миеломе и ХЛЛ, что свидетельствует о силе аутокринного воздействия bFGF на опухолевые клетки этих типов. Было продемонстрировано, что bFGF стимулирует in vitro колониеобразование лейкозных клеток, выделенных у пациентов с хроническим миеломоноцитарным лейкозом, в то время как нейтрализация bFGF с помощью антител подавляет подобные эффекты. Кроме того, активизация клеток эндотелия bFGF приводит к производству дополнительных цитокинов и гематопоэтических факторов роста (например, Г-КСФ, ИЛ-6 и ИЛ-8), которые, в свою очередь, на протяжении всего периода действия паракринного механизма способствуют росту лейкозных клеток [2]. Известно, что стволовые клетки функционируют в тесном контакте с кроветворным микроокружением. Важным компонентом кроветворного микроокружения являются веретеновидные остеобласты, формирующие вместе с другими клетками функциональную нишу для покоящихся стволовых клеткок [4]. Ниша для пролиферирующих СКК располагается в синусах костного мозга и связана с эндотелиальными клетками, экспрессирующими различные факторы роста. Одним из важнейших является фактор роста и регуляции клеток эндотелия bFGF. Нарушение взаимодействия стволовой кроветворной клетки со своим микроокружением может приводить к патологическим изменениям пролиферации и дифференцировке стволовых клеток и, как следствие, развитию ХЛЛ.
Выводы
Таким образом, в результате проведенного исследования нами были определены маркеры риска развития ХЛЛ: аллель С полиморфного локуса 773C > T гена bFGF (OR = 1,57).
Список литературы
- Di Bernardo M.C., Crowther-Swanepoel D., Broderick P., Webb E., Sellick G., Wild R., et al. A genome-wide association study identifies six susceptibility loci for chronic lymphocytic leukemia // Nat Genet. - 2008. - Vol. 40. - P. 1204-1215.
- Faloon P., Arentson E., Kazarov A., Deng С.X., Porcher C., Orkin S., Choi K. Basic fibroblast growth factor positively regulates hematopoietic development. - 2000, Development 127. - Р. 1931-1941.
- Hiroshi Hirata1, Yuji Hinoda2, Nobuyuki Kikuno1, Ken Kawamoto1, Yutaka Suehiro2, Yuichiro Tanaka1 and Rajvir Dahiya1 MDM2 SNP309 Polymorphism as Risk Factor for Susceptibility and Poor Prognosis in Renal Cell Carcinoma // Clinical Cancer Research. - 2007. - Vol. 13. - P. 123-129.
- Huizinga T.W., Westendorp R.G., Bollen E.L., Keijsers V., Brinkman B.M., Langermans J.A., Breedveld F.C., Verweij C.L., van de Gaer L., Dams L., Crusius J.B., García-Gonzalez A., van Oosten B.W., Polman C.H., Peña A.S. TNF-alpha promoter polymorphisms, production and susceptibility to multiple sclerosis in different groups of patients // J Neuroimmunol. - 1997. - Vol. 72. - P. 53-58.
- Linet M.S., Schubauer-Berigan M.K., Weisenburger D.D., Richardson D.B., Landgren O., Blair A., et al. Chronic lymphocytic leukaemia: an overview of aetiology in light of recent developments in classification and pathogenesis // Br J. Haematol. - 2007. - Vol. 139. - P. 86-94.
- Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. Ed. Walker J.M. - N.Y., L.: Human Press. - 1984. - Vol. 2. - P. 31.
- Role of Raf in vascular protection from distinct apoptotic stimuli / A. Alavi, J.D. Hood, R. Frausto, D.G. Stupack, D.A. Cheresh Science. - 2003 Jul 4. - Vol. 301(5629). - P. 94-6.
Рецензенты:
Гимранова Г.Г., д.м.н., зам. директора ФГУН «Уфимский НИИ Медицины труда и экологии человека» Роспотребнадзора, г. Уфа;
Максимов А.Г., д.м.н., доцент, доцент кафедры факультетской терапии ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ, г. Санкт-Петербург.