Адренергические соединения, тиреоидные гормоны и глюкокортикоиды играют важную роль в нейроэндокринной регуляции функций иммунной системы в норме и патологии [4, 8]. Известно, что тиреоидные гормоны и глюкокортикоиды повышают экспрессию бета-адренорецепторов и/или внутриклеточную трансдукцию с них сигнала в клетках-мишенях различных органов [5, 9]. Функциональные последствия реализации такого взаимодействия на уровне иммунной системы изучены недостаточно.
Цель работы - исследование влияния агониста бета-адренорецепторов гексопреналина сульфата на пролиферативный ответ лимфоцитов и продукцию иммуноглобулинов в присутствии тироксина и дексаметазона фосфата в системе in vitro.
Материал и методы исследования
Объектом исследования служили лейкоциты периферической венозной крови, полученной от 17 практически здоровых мужчин-добровольцев (средний возраст - 24 года). Использовали следующие соединения: агонист бета-адренорецепторов гексопреналина сульфат («гинипрал®», Nycomed, Австрия), действующий более избирательно на бета2-адренорецепторы, в концентрации 10-6 М; растворимую форму L-тироксина - пентагидрат натриевой соли L-тироксина (Sigma, США, Т0397) в концентрациях 10-8, 10-9 и 10-10 М; селективный агонист стероидных адреналовых рецепторов II типа дексаметазона фосфат (KRKA, Словения) в концентрации 10-7 М. Исследованные концентрации соединений сопоставимы для агониста бета-адренорецепторов с уровнем катехоламинов в органах лимфомиелоидного комплекса [10], тироксина - с уровнем свободного тироксина в крови при тиреотоксикозе разной степени выраженности [7], а дексаметазона фосфата - с уровнем глюкокортикоидов при стрессе [6]. Все исследуемые соединения вносили в культуры одновременно с митогеном.
Поликлональный тимусзависимый пролиферативный ответ В-лимфоцитов оценивали в культурах с митогеном лаконоса (PWM, Sigma, США, L8777) в оптимальной концентрации 2,5 мкг/мл или без него в среде 199 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 10 мМ HEPES, 100 мкг/мл гентамицина сульфата и 10 % аутоплазмы (2⋅105 мононуклеарных клеток на лунку круглодонного 96-луночного планшета, общий объем культуры 0,2 мл). Через 48 или 96 ч культивирования во влажной атмосфере с 5 % СО2 при 37 °С вносили по 1 мкКи (37 кБк) метил-3Н-тимидина (ОАО «Изотоп», С.-Петербург). Через 24 ч (соответственно через 72 или 120 ч от начала культивирования) клетки осаждали на мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм. Уровень радиоактивности в кислотонерастворимой фракции оценивали на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Guardian» WinSpectral DSA 1414-03 («Wallac», Финляндия) в подразделении радиоизотопных исследований лаборатории биохимии развития микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН.
Для оценки поликлональной тимусзависимой продукции иммуноглобулинов культивирование мононуклеарных клеток с PWM осуществляли в аналогичных условиях в течение 288 ч, но в культуральную среду вместо аутоплазмы вносили 10 % сыворотки крови плодов коровы (SUS-BIOL, Биолот, Россия). Определение концентрации иммуноглобулинов в супернатантах культур проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем согласно инструкции производителя («IgM общий-ИФА-БЕСТ», Вектор-Бест, Новосибирск, A-8664; «IgG общий - ИФА - БЕСТ», Вектор-Бест, Новосибирск, А-8662). Контрольные исследования с сывороткой крови плодов коровы и указанными тест-системами показали полное отсутствие перекрестных реакций, IgM и IgG не выявлялись даже при использовании цельной сыворотки. При выборочном исследовании супернатантов 288-часовых культур без PWM выявлялись лишь следовые количества этих белков на грани чувствительности тест-систем, поэтому спонтанную продукцию иммуноглобулинов и влияние на нее соединений в дальнейшем не исследовали. Состояние всех культур дополнительно контролировали морфологически на препаратах, окрашенных по Романовскому.
Изменение пролиферативного ответа лимфоцитов на Т-клеточный митоген в присутствии дексаметазона фосфата и гексопреналина сульфата оценивали в 72-часовых культурах с фитогемагглютинином-П (ФГА, Sigma, США, L9132) в концентрациях 2,5, 5,0, 10,0, 20,0 и 40,0 мкг/мл. Условия культивирования лейкоцитов аналогичны вышеописанным для 72-часовых культур с PWM.
Статистический анализ результатов проводили с учетом log-нормального распределения показателей пролиферации лимфоцитов и концентрации иммуноглобулинов в культурах. Для оценки статистической значимости различий связанных попарно данных использовали непараметрический ранговый критерий Вилкоксона и t-критерий Стьюдента для парных данных. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
При совместном воздействии тироксина в концентрации 10-10 М с агонистом бета-адренорецепторов гексопреналином сульфатом выявляется статистически значимое в сравнении с контролем снижение пролиферации лимфоцитов в 120-часовых культурах с PWM (табл. 1). В культурах с одновременным внесением бета-адренергического агониста и тироксина в концентрации 10-9 М уровень пролиферации в 72-часовых культурах с PWM снижается в сравнении с культурами с добавлением только тироксина или гексопреналина сульфата, а в 120-часовых - по отношению к культурам только с бета-адреномиметиком. При концентрации тироксина 10-8 М изменения отсутствуют. При внесении в культуры тироксина без агониста бета-адренорецепторов отмечается только снижение спонтанной пролиферации лимфоцитов в 120-часовых культурах без митогена при концентрации гормона 10-9 М, а одного бета-адренергического агониста - отсутствие изменений.
Тироксин в концентрациях 10-8 и 10-9 М повышает в сравнении с контролем продукцию IgG в 288-часовых культурах мононуклеарных клеток с PWM, не влияя на уровень IgM (табл. 2). Внесение совместно с тироксином агониста бета-адренорецепторов отменяет этот эффект, концентрация IgG в этих культурах не отличается от контроля.
Ранее в условиях in vivo показано, что гексопреналина сульфат отменяет стимуляцию антителообразования и реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) при развитии иммунного ответа на тимусзависимый антиген в условиях экспериментального тиреотоксикоза, вызванного 14-дневным введением крысам тироксина в суточной дозе 0,04 мг/кг [1]. Эти, а также полученные в настоящей работе, данные об угнетении пролиферативного ответа лимфоцитов в культурах с PWM и отмене стимулирующего действия тироксина на продукцию IgG при совместном воздействии бета-адренергического агониста и тироксина, указывают на участие индуцируемого тироксином повышения чувствительности клеток к бета-адренергической регуляции в изменениях функций иммунной системы при тиреотоксикозе. Как было показано ранее, при более тяжелой форме экспериментального тиреотоксикоза у крыс, вызванного введением тироксина в суточной дозе 4 мг/кг, супрессия антителообразования и реакции ГЗТ отменяется при фармакологической блокаде бета-адренорецепторов соталолом гидрохлоридом [2], что указывает на участие в ее формировании эндогенных катехоламинов в условиях повышения чувствительности клеток к бета-адренергической стимуляции.
Дексаметазона фосфат не влияет в сравнении с контролем на продукцию иммуноглобулинов и пролиферацию лимфоцитов в культурах с PWM при внесении в них как отдельно, так и совместно с агонистом бета-адренорецепторов (табл. 3 и 4). Выявляется только снижение уровня IgG в культурах с совместным внесением глюкокортикоида и бета-адренергического агониста в сравнении с культурами только с дексаметазоном.
Таблица 1
Влияние гексопреналина сульфата и тироксина на пролиферативный
ответ лимфоцитов в культурах с PWM
Концентрация тироксина |
Культуры |
Срок культивирования |
|||
72 ч |
120 ч |
||||
без митогена |
PWM, 2,5 мкг/мл |
без митогена |
PWM, 2,5 мкг/мл |
||
10-8 М |
с агонистом |
3,1687 ± 0,2407 (1474,6) |
4,1413 ± 0,1282 (13844,2) |
2,9695 ± 0,4534 (932,3) |
3,7279 ± 0,4903 (5344,3) |
без агониста |
3,1560 ± 0,2080 (1432,3) |
4,2145 ± 0,1287 (16385,3) |
2,9035 ± 0,4373 (800,8) |
3,6050 ± 0,4702 (4027,1) |
|
10-9 М |
с агонистом |
3,0588 ± 0,2160 (1145,0) |
3,9513 ± 0,1306 (8938,9)cd |
2,7389 ± 0,4073 (548,2) |
3,7510 ± 0,4524 (5635,9)c |
без агониста |
3,0532 ± 0,1939 (1130,4) |
4,2541 ± 0,1180 (17951,5) |
2,7420 ± 0,3936 (552,1)*# |
3,8123 ± 0,4682 (6491,6) |
|
10-10 М |
с агонистом |
3,2075 ± 0,1658 (1612,5) |
3,9566 ± 0,3571 (9049,6) |
3,2319 ± 0,3349 (1705,8) |
3,9734 ± 0,3793 (9405,8)# |
без агониста |
3,2281 ± 0,1485 (1690,9) |
4,2135 ± 0,1093 (16347,7) |
3,2574 ± 0,3727 (1808,6) |
4,1097 ± 0,4101 (12872,9) |
|
Без тироксина |
с агонистом |
3,3438 ± 0,1934 (2206,9) |
4,2404 ± 0,1086 (17395,1) |
3,3391 ± 0,3348 (2183,4) |
4,2377 ± 0,3145 (17286,0) |
без агониста (контроль) |
2,9994 ± 0,2095 (998,5) |
4,1774 ± 0,0897 (15044,7) |
3,5220 ± 0,1374 (3326,7) |
4,5304 ± 0,0668 (33913,3) |
Примечание. Число обследованных людей в контроле и опытных выборках равно 7. Приведены значения M ± m для показателей log10 имп/мин, а в скобках - средние геометрические имп/мин (антилогарифм из M log10 имп./мин). Здесь и в табл. 2-4: * - p < 0,05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю; a - то же по отношению к агонисту; b - то же по отношению к тироксину или дексаметазону; # - p < 0,05 по парному критерию Вилкоксона по отношению к контролю; с - то же по отношению к агонисту; d - то же по отношению к тироксину или дексаметазону.
Таблица 2
Влияние гексопреналина сульфата и тироксина на продукцию иммуноглобулинов
в 288-часовых культурах с PWM
Концентрация тироксина |
Культуры |
Концентрация иммуноглобулинов |
|
IgM |
IgG |
||
10-8 М |
с агонистом |
2,7161 ± 0,1906 (520,1) |
2,7412 ± 0,2509 (551,1) |
без агониста |
2,7244 ± 0,1936 (530,1) |
3,0306 ± 0,1722 (1072,9)# |
|
10-9 М |
с агонистом |
2,5406 ± 0,1922 (347,2) |
2,8527 ± 0,1433 (712,4) |
без агониста |
2,5979 ± 0,2370 (396,2) |
3,0076 ± 0,1761 (1017,5)# |
|
10-10 М |
с агонистом |
2,7704 ± 0,1733 (589,4) |
2,8944 ± 0,2291 (784,1) |
без агониста |
2,6246 ± 0,1771 (421,3) |
2,8721 ± 0,1971 (744,9) |
|
Без тироксина |
с агонистом |
2,4325 ± 0,2119 (270,7) |
2,6704 ± 0,2967 (468,2) |
без агониста (контроль) |
2,6834 ± 0,1688 (482,4) |
2,6382 ± 0,3000 (434,7) |
Примечание. Число обследованных людей в контроле и опытных выборках равно 6. Приведены значения M ± m для показателей log10 концентрации, а в скобках - средние геометрические концентрации иммуноглобулинов в нг/мл. Остальные обозначения те же, что и в табл. 1.
Таблица 3
Влияние гексопреналина сульфата и дексаметазона фосфата на пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с PWM
Препарат, концентрация |
Культуры |
Срок культивирования |
|||
72 ч |
120 ч |
||||
без митогена |
PWM, |
без митогена |
PWM, |
||
Дексаметазона |
С агонистом |
2,9806 ± 0,2070 (956,2) |
3,9445 ± 0,2358 (8800,5) |
3,3812 ± 0,1212 (2405,3) |
4,3334 ± 0,2390 (21549,5) |
Фосфат, 10-7 М |
Без агониста |
2,9633 ± 0,2182 (919,0) |
3,9017 ± 0,2259 (7974,2) |
3,2127 ± 0,1788 (1632,0) |
4,3593 ± 0,1972 (22869,9) |
Без глюкокортикои дов |
С агонистом |
3,2571 ± 0,1886 (1807,6) |
3,9983 ± 0,2598 (9960,3) |
3,3139 ± 0,2910 (2060,0) |
4,1996 ± 0,2750 (15833,0) |
Без агониста (контроль) |
3,0330 ± 0,1674 (1109,5) |
4,0713 ± 0,1433 (11783,2) |
3,4259 ± 0,1710 (2666,5) |
4,3344 ± 0,2257 (21598,7) |
Примечание. Число обследованных людей в контроле и опытных выборках равно 8. Приведены значения M ± m для показателей log10 имп/мин, а в скобках - средние геометрические имп/мин. Остальные обозначения те же, что и в табл. 1.
Таблица 4
Влияние гексопреналина сульфата и дексаметазона фосфата на продукцию иммуноглобулинов в 288-часовых культурах с PWM
Препарат, |
Культуры |
Концентрация иммуноглобулинов |
|
IgM |
IgG |
||
Дексаметазона |
с агонистом |
2,6693 ± 0,1046 (467,0) |
2,5805 ± 0,1926 (380,7) b |
фосфат, 10-7 М |
без агониста |
2,6769 ± 0,1313 (475,3) |
2,8239 ± 0,2022 (666,6) |
Без глюко- |
с агонистом |
2,4325 ± 0,2119 (270,7) |
2,9226 ± 0,1913 (836,8) |
кортикоидов |
без агониста (контроль) |
2,6087 ± 0,1417 (406,2) |
2,7350 ± 0,2037 (543,2) |
Примечание. Число обследованных людей в контроле и опытных выборках равно 7. Приведены значения M ± m для показателей log10 концентрации, а в скобках - средние геометрические концентрации иммуноглобулинов в нг/мл. Остальные обозначения те же, что и в табл. 1.
В отличие от культур с PWM пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с ФГА в присутствии дексаметазона фосфата статистически значимо угнетается при оптимальной концентрации митогена (10 мкг/мл), но не отличается от контроля в диапазоне суб- и гипероптимальных концентраций ФГА (табл. 5). При совместном внесении глюкокортикоида и бета-адренергического агониста супрессия пролиферации лимфоцитов регистрируется и в диапазоне суб- и гипероптимальных концентраций Т-клеточного митогена, при этом уровень пролиферативного ответа в культурах с 5 мкг/мл ФГА статистически значимо ниже в сравнении не только с контролем, но и с культурами с внесением одного дексаметазона. Изменения пролиферативного ответа в культурах с добавлением только гексопреналина сульфата отсутствуют. Результаты этого раздела работы свидетельствуют о том, что синергизм в иммуносупрессивном действии агонистов глюкокортикоидных рецепторов и бета-адренорецепторов наиболее выражен при развитии in vitro поликлонального Т-клеточного ответа, в то время как пролиферативный ответ В-лимфоцитов и продукция иммуноглобулинов в культурах при поликлональной тимусзависимой активации PWM относительно резистентны к иммуносупрессивному действию этих соединений. Ранее показано, что в условиях острого стресса (24-часовая иммобилизация в сочетании с дозированной кровопотерей) у крыс развивается выраженная супрессия реакции ГЗТ при отсутствии изменения антителообразования в регионарном лимфатическом узле [3]. В связи с тем, что угнетение реакции ГЗТ отменяется при фармакологической блокаде периферических бета-адренорецепторов, можно считать, что в развитии стрессорной иммуносупрессии участвуют эндогенные катехоламины в условиях повышения чувствительности клеток иммунной системы к бета-адренергической стимуляции. С другой стороны, полученные в настоящей работе на модельной системе in vitro результаты подтверждают наличие синергизма иммуносупрессивного действия комбинаций синтетических глюкокортикоидов и агонистов бета-адренорецепторов, что используется в терапии ряда заболеваний, в частности - бронхиальной астмы [5].
Таблица 5
Влияние гексопреналина сульфата и дексаметазона фосфата на пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с ФГА
Препарат, |
Культуры |
Без митогена |
ФГА, мкг/мл |
||||
2,5 |
5,0 |
10,0 |
20,0 |
40,0 |
|||
Дексаметазона фосфат, 10-7 М |
С агонистом |
3,3985 ± 0,0942 (2503,0)c |
3,6318 ± 0,0636 (4283,4) |
3,7422 ± 0,1036 (5523,1)*#cd |
3,9651 ± 0,1254 (9227,1)*#c |
3,9546 ± 0,1400 (9006,8)*#c |
4,0021 ± 0,0934 (10049,3)*#c |
Без агониста |
3,4767 ± 0,1252 (2996,8) |
3,6701 ± 0,0788 (4678,5) |
3,9764 ± 0,0762 (9470,6)b |
4,0396 ± 0,1000 (10955,4)*# |
4,1439 ± 0,1092 (13929,6) |
4,0624 ± 0,1407 (11545,7) |
|
Без глюкокортикоидов |
С агонистом |
3,6403 ± 0,0745 (4368,4) |
3,8318 ± 0,0793 (6789,1) |
4,0294 ± 0,1200 (10701,6) |
4,1689 ± 0,1031 (14753,4) |
4,1852 ± 0,1137 (15319,2) |
4,2952 ± 0,1058 (19733,4) |
Без агониста (контроль) |
3,5028 ± 0,0725 (3183,1) |
3,7715 ± 0,0966 (5909,2) |
4,0141 ± 0,1199 (10330,5) |
4,3109 ± 0,0881 (20458,4) |
4,2045 ± 0,1066 (16014,2) |
4,2003 ± 0,0916 (15860,0) |
Примечание. Число обследованных людей в контроле и опытных выборках равно 9. Приведены значения M ± m для показателей log10 имп./мин, а в скобках - средние геометрические имп/мин. Остальные обозначения те же, что и в табл. 1.
Заключение
Таким образом, выявлены угнетение пролиферативного ответа лимфоцитов и отмена стимулирующего действия тироксина на продукцию IgG в культурах мононуклеарных клеток периферической крови практически здоровых людей с митогеном лаконоса при совместном воздействии гексопреналина сульфата и тироксина. Установлено, что синергизм в иммуносупрессивном действии дексаметазона фосфата и гексопреналина сульфата in vitro наиболее выражен при развитии пролиферативного ответа лимфоцитов на фитогемагглютинин, в то время как пролиферация лимфоцитов и продукция иммуноглобулинов в культурах с митогеном лаконоса относительно резистентны к иммуносупрессивному действию этих соединений.
Исследования поддержаны грантами РФФИ 10-04-96092-р-Урал-а и 11-04-96047-р-Урал-а, Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
Список литературы
- Годовалов А.П., Шилов Ю.И. Влияние агониста бета-адренорецепторов гексопреналина сульфата на иммунный ответ в условиях экспериментального гипертиреоза // Вестн. Уральской медицинской академической науки. - 2006. - № 3-1(14). - С. 40-42.
- Годовалов А.П., Шилов Ю.И. Влияние адренергических соединений на иммунный ответ при экспериментальном тиреотоксикозе // Вестн. Уральской медицинской академической науки. - 2009. - № 2/1 (24). - C. 90-91.
- Шилов Д.Ю., Шилов Ю.И., Черешнев В.А. Влияние соталола гидрохлорида на иммунный ответ при остром стрессе // Вестн. Уральской медицинской академической науки. - 2009. - № 2/1 (24). - C. 63-64.
- Besedovsky H.O., del Rey A. Physiology of psychoneuroimmunology: A personal view // Brain, Behavior, and Immunity. - 2007. - Vol. 21. - P. 34-44.
- Black J.L., Oliver B.G., Roth M. Molecular mechanisms of combination therapy with inhaled corticosteroids and long-acting beta-agonists // Chest. - 2009. - Vol. 136(4). - P. 1095-1100.
- Djordjevic J., Djordjevic A., Adzic M. et al. Chronic stress differentially affects antioxidant enzymes and modifies the acute stress response in liver of Wistar rats // Physiol. Res. - 2010. - Vol. 59(5). - P. 729-736.
- Kato K., Murakami H., Isozaki O. et al. Serum concentrations of BNP and ANP in patients with thyrotoxicosis // Endocr. J. - 2009. - Vol. 56(1). - P. 17-27.
- Klecha A.J., Genaro A.M., Gorelik G. et al. Integrative study of hypothalamus-pituitary-thyroid-immune system interaction: thyroid hormone-mediated modulation of lymphocyte activity through the protein kinase C signaling pathway // J. Endocrinol. - 2006. - Vol. 189(1). - P. 45-55.
- Pappas M., Mourouzis K., Karageorgiou H. et al. Thyroid hormone modulates the responsiveness of rat aorta to alpha1-adrenergic stimulation: an effect due to increased activation of beta2-adrenergic signaling // Int. Angiol. - 2009. - Vol. 28(6). - P. 474-478.
- Rogausch H., Bock T., Voigt K.H., Besedovsky H. The sympathetic control of blood supply is different in the spleen and lymph nodes // Neuroimmunomodulation. - 2004. - Vol. 11 (1). - P. 58-64.
Рецензенты:
Косарева П.В., д.м.н., зав. морфологическим отделом ЦНИЛ ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава», г. Пермь;
Кузнецов В.Ф., д.м.н., профессор, зав. кафедрой нормальной физиологии ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава», г. Пермь.