Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы

Шилов Д.Ю., Годовалов А.П., Шилов Ю.И., Юркова Е.В.

Выявлены угнетение пролиферативного ответа лимфоцитов и отмена стимулирующего действия тироксина на продукцию IgG в культурах мононуклеарных клеток периферической крови практически здоровых людей с митогеном лаконоса при совместном воздействии гексопреналина сульфата и тироксина. Установлено, что синергизм в иммуносупрессивном действии дексаметазона фосфата и гексопреналина сульфата in vitro наиболее выражен при развитии пролиферативного ответа лимфоцитов на фитогемагглютинин, в то время как пролиферация лимфоцитов и продукция иммуноглобулинов в культурах с митогеном лаконоса относительно резистентны к иммуносупрессивному действию этих соединений.

Статья в формате PDF

281 KB

Адренергические соединения, тиреоидные гормоны и глюкокортикоиды играют важную роль в нейроэндокринной регуляции функций иммунной системы в норме и патологии [4, 8]. Известно, что тиреоидные гормоны и глюкокортикоиды повышают экспрессию бета-адренорецепторов и/или внутриклеточную трансдукцию с них сигнала в клетках-мишенях различных органов [5, 9]. Функциональные последствия реализации такого взаимодействия на уровне иммунной системы изучены недостаточно.

Цель работы - исследование влияния агониста бета-адренорецепторов гексопреналина сульфата на пролиферативный ответ лимфоцитов и продукцию иммуноглобулинов в присутствии тироксина и дексаметазона фосфата в системе in vitro.

Материал и методы исследования

Объектом исследования служили лейкоциты периферической венозной крови, полученной от 17 практически здоровых мужчин-добровольцев (средний возраст - 24 года). Использовали следующие соединения: агонист бета-адренорецепторов гексопреналина сульфат («гинипрал®», Nycomed, Австрия), действующий более избирательно на бета2-адренорецепторы, в концентрации 10^-6 М; растворимую форму L-тироксина - пентагидрат натриевой соли L-тироксина (Sigma, США, Т0397) в концентрациях 10^-8, 10^-9 и 10^-10 М; селективный агонист стероидных адреналовых рецепторов II типа дексаметазона фосфат (KRKA, Словения) в концентрации 10^-7 М. Исследованные концентрации соединений сопоставимы для агониста бета-адренорецепторов с уровнем катехоламинов в органах лимфомиелоидного комплекса [10], тироксина - с уровнем свободного тироксина в крови при тиреотоксикозе разной степени выраженности [7], а дексаметазона фосфата - с уровнем глюкокортикоидов при стрессе [6]. Все исследуемые соединения вносили в культуры одновременно с митогеном.

Поликлональный тимусзависимый пролиферативный ответ В-лимфоцитов оценивали в культурах с митогеном лаконоса (PWM, Sigma, США, L8777) в оптимальной концентрации 2,5 мкг/мл или без него в среде 199 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 10 мМ HEPES, 100 мкг/мл гентамицина сульфата и 10 % аутоплазмы (2⋅10⁵ мононуклеарных клеток на лунку круглодонного 96-луночного планшета, общий объем культуры 0,2 мл). Через 48 или 96 ч культивирования во влажной атмосфере с 5 % СО2 при 37 °С вносили по 1 мкКи (37 кБк) метил-³Н-тимидина (ОАО «Изотоп», С.-Петербург). Через 24 ч (соответственно через 72 или 120 ч от начала культивирования) клетки осаждали на мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм. Уровень радиоактивности в кислотонерастворимой фракции оценивали на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Guardian» WinSpectral DSA 1414-03 («Wallac», Финляндия) в подразделении радиоизотопных исследований лаборатории биохимии развития микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН.

Для оценки поликлональной тимусзависимой продукции иммуноглобулинов культивирование мононуклеарных клеток с PWM осуществляли в аналогичных условиях в течение 288 ч, но в культуральную среду вместо аутоплазмы вносили 10 % сыворотки крови плодов коровы (SUS-BIOL, Биолот, Россия). Определение концентрации иммуноглобулинов в супернатантах культур проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем согласно инструкции производителя («IgM общий-ИФА-БЕСТ», Вектор-Бест, Новосибирск, A-8664; «IgG общий - ИФА - БЕСТ», Вектор-Бест, Новосибирск, А-8662). Контрольные исследования с сывороткой крови плодов коровы и указанными тест-системами показали полное отсутствие перекрестных реакций, IgM и IgG не выявлялись даже при использовании цельной сыворотки. При выборочном исследовании супернатантов 288-часовых культур без PWM выявлялись лишь следовые количества этих белков на грани чувствительности тест-систем, поэтому спонтанную продукцию иммуноглобулинов и влияние на нее соединений в дальнейшем не исследовали. Состояние всех культур дополнительно контролировали морфологически на препаратах, окрашенных по Романовскому.

Изменение пролиферативного ответа лимфоцитов на Т-клеточный митоген в присутствии дексаметазона фосфата и гексопреналина сульфата оценивали в 72-часовых культурах с фитогемагглютинином-П (ФГА, Sigma, США, L9132) в концентрациях 2,5, 5,0, 10,0, 20,0 и 40,0 мкг/мл. Условия культивирования лейкоцитов аналогичны вышеописанным для 72-часовых культур с PWM.

Статистический анализ результатов проводили с учетом log-нормального распределения показателей пролиферации лимфоцитов и концентрации иммуноглобулинов в культурах. Для оценки статистической значимости различий связанных попарно данных использовали непараметрический ранговый критерий Вилкоксона и t-критерий Стьюдента для парных данных. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

При совместном воздействии тироксина в концентрации 10^-10 М с агонистом бета-адренорецепторов гексопреналином сульфатом выявляется статистически значимое в сравнении с контролем снижение пролиферации лимфоцитов в 120-часовых культурах с PWM (табл. 1). В культурах с одновременным внесением бета-адренергического агониста и тироксина в концентрации 10^-9 М уровень пролиферации в 72-часовых культурах с PWM снижается в сравнении с культурами с добавлением только тироксина или гексопреналина сульфата, а в 120-часовых - по отношению к культурам только с бета-адреномиметиком. При концентрации тироксина 10^-8 М изменения отсутствуют. При внесении в культуры тироксина без агониста бета-адренорецепторов отмечается только снижение спонтанной пролиферации лимфоцитов в 120-часовых культурах без митогена при концентрации гормона 10^-9 М, а одного бета-адренергического агониста - отсутствие изменений.

Тироксин в концентрациях 10^-8 и 10^-9 М повышает в сравнении с контролем продукцию IgG в 288-часовых культурах мононуклеарных клеток с PWM, не влияя на уровень IgM (табл. 2). Внесение совместно с тироксином агониста бета-адренорецепторов отменяет этот эффект, концентрация IgG в этих культурах не отличается от контроля.

Ранее в условиях in vivo показано, что гексопреналина сульфат отменяет стимуляцию антителообразования и реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) при развитии иммунного ответа на тимусзависимый антиген в условиях экспериментального тиреотоксикоза, вызванного 14-дневным введением крысам тироксина в суточной дозе 0,04 мг/кг [1]. Эти, а также полученные в настоящей работе, данные об угнетении пролиферативного ответа лимфоцитов в культурах с PWM и отмене стимулирующего действия тироксина на продукцию IgG при совместном воздействии бета-адренергического агониста и тироксина, указывают на участие индуцируемого тироксином повышения чувствительности клеток к бета-адренергической регуляции в изменениях функций иммунной системы при тиреотоксикозе. Как было показано ранее, при более тяжелой форме экспериментального тиреотоксикоза у крыс, вызванного введением тироксина в суточной дозе 4 мг/кг, супрессия антителообразования и реакции ГЗТ отменяется при фармакологической блокаде бета-адренорецепторов соталолом гидрохлоридом [2], что указывает на участие в ее формировании эндогенных катехоламинов в условиях повышения чувствительности клеток к бета-адренергической стимуляции.

Дексаметазона фосфат не влияет в сравнении с контролем на продукцию иммуноглобулинов и пролиферацию лимфоцитов в культурах с PWM при внесении в них как отдельно, так и совместно с агонистом бета-адренорецепторов (табл. 3 и 4). Выявляется только снижение уровня IgG в культурах с совместным внесением глюкокортикоида и бета-адренергического агониста в сравнении с культурами только с дексаметазоном.

Таблица 1

Влияние гексопреналина сульфата и тироксина на пролиферативный
ответ лимфоцитов в культурах с PWM

Примечание. Число обследованных людей в контроле и опытных выборках равно 7. Приведены значения M ± m для показателей log10 имп/мин, а в скобках - средние геометрические имп/мин (антилогарифм из M log10 имп./мин). Здесь и в табл. 2-4: * - p < 0,05 по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю; a - то же по отношению к агонисту; b - то же по отношению к тироксину или дексаметазону; # - p < 0,05 по парному критерию Вилкоксона по отношению к контролю; с - то же по отношению к агонисту; d - то же по отношению к тироксину или дексаметазону.

Таблица 2

Влияние гексопреналина сульфата и тироксина на продукцию иммуноглобулинов
в 288-часовых культурах с PWM

Примечание. Число обследованных людей в контроле и опытных выборках равно 6. Приведены значения M ± m для показателей log₁₀ концентрации, а в скобках - средние геометрические концентрации иммуноглобулинов в нг/мл. Остальные обозначения те же, что и в табл. 1.

Таблица 3

Влияние гексопреналина сульфата и дексаметазона фосфата на пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с PWM

Примечание. Число обследованных людей в контроле и опытных выборках равно 8. Приведены значения M ± m для показателей log10 имп/мин, а в скобках - средние геометрические имп/мин. Остальные обозначения те же, что и в табл. 1.

Таблица 4

Влияние гексопреналина сульфата и дексаметазона фосфата на продукцию иммуноглобулинов в 288-часовых культурах с PWM

Примечание. Число обследованных людей в контроле и опытных выборках равно 7. Приведены значения M ± m для показателей log10 концентрации, а в скобках - средние геометрические концентрации иммуноглобулинов в нг/мл. Остальные обозначения те же, что и в табл. 1.

В отличие от культур с PWM пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с ФГА в присутствии дексаметазона фосфата статистически значимо угнетается при оптимальной концентрации митогена (10 мкг/мл), но не отличается от контроля в диапазоне суб- и гипероптимальных концентраций ФГА (табл. 5). При совместном внесении глюкокортикоида и бета-адренергического агониста супрессия пролиферации лимфоцитов регистрируется и в диапазоне суб- и гипероптимальных концентраций Т-клеточного митогена, при этом уровень пролиферативного ответа в культурах с 5 мкг/мл ФГА статистически значимо ниже в сравнении не только с контролем, но и с культурами с внесением одного дексаметазона. Изменения пролиферативного ответа в культурах с добавлением только гексопреналина сульфата отсутствуют. Результаты этого раздела работы свидетельствуют о том, что синергизм в иммуносупрессивном действии агонистов глюкокортикоидных рецепторов и бета-адренорецепторов наиболее выражен при развитии in vitro поликлонального Т-клеточного ответа, в то время как пролиферативный ответ В-лимфоцитов и продукция иммуноглобулинов в культурах при поликлональной тимусзависимой активации PWM относительно резистентны к иммуносупрессивному действию этих соединений. Ранее показано, что в условиях острого стресса (24-часовая иммобилизация в сочетании с дозированной кровопотерей) у крыс развивается выраженная супрессия реакции ГЗТ при отсутствии изменения антителообразования в регионарном лимфатическом узле [3]. В связи с тем, что угнетение реакции ГЗТ отменяется при фармакологической блокаде периферических бета-адренорецепторов, можно считать, что в развитии стрессорной иммуносупрессии участвуют эндогенные катехоламины в условиях повышения чувствительности клеток иммунной системы к бета-адренергической стимуляции. С другой стороны, полученные в настоящей работе на модельной системе in vitro результаты подтверждают наличие синергизма иммуносупрессивного действия комбинаций синтетических глюкокортикоидов и агонистов бета-адренорецепторов, что используется в терапии ряда заболеваний, в частности - бронхиальной астмы [5].

Таблица 5

Влияние гексопреналина сульфата и дексаметазона фосфата на пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с ФГА

Примечание. Число обследованных людей в контроле и опытных выборках равно 9. Приведены значения M ± m для показателей log10 имп./мин, а в скобках - средние геометрические имп/мин. Остальные обозначения те же, что и в табл. 1.

Заключение

Таким образом, выявлены угнетение пролиферативного ответа лимфоцитов и отмена стимулирующего действия тироксина на продукцию IgG в культурах мононуклеарных клеток периферической крови практически здоровых людей с митогеном лаконоса при совместном воздействии гексопреналина сульфата и тироксина. Установлено, что синергизм в иммуносупрессивном действии дексаметазона фосфата и гексопреналина сульфата in vitro наиболее выражен при развитии пролиферативного ответа лимфоцитов на фитогемагглютинин, в то время как пролиферация лимфоцитов и продукция иммуноглобулинов в культурах с митогеном лаконоса относительно резистентны к иммуносупрессивному действию этих соединений.

Исследования поддержаны грантами РФФИ 10-04-96092-р-Урал-а и 11-04-96047-р-Урал-а, Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Список литературы

1. Годовалов А.П., Шилов Ю.И. Влияние агониста бета-адренорецепторов гексопреналина сульфата на иммунный ответ в условиях экспериментального гипертиреоза // Вестн. Уральской медицинской академической науки. - 2006. - № 3-1(14). - С. 40-42.
2. Годовалов А.П., Шилов Ю.И. Влияние адренергических соединений на иммунный ответ при экспериментальном тиреотоксикозе // Вестн. Уральской медицинской академической науки. - 2009. - № 2/1 (24). - C. 90-91.
3. Шилов Д.Ю., Шилов Ю.И., Черешнев В.А. Влияние соталола гидрохлорида на иммунный ответ при остром стрессе // Вестн. Уральской медицинской академической науки. - 2009. - № 2/1 (24). - C. 63-64.
4. Besedovsky H.O., del Rey A. Physiology of psychoneuroimmunology: A personal view // Brain, Behavior, and Immunity. - 2007. - Vol. 21. - P. 34-44.
5. Black J.L., Oliver B.G., Roth M. Molecular mechanisms of combination therapy with inhaled corticosteroids and long-acting beta-agonists // Chest. - 2009. - Vol. 136(4). - P. 1095-1100.
6. Djordjevic J., Djordjevic A., Adzic M. et al. Chronic stress differentially affects antioxidant enzymes and modifies the acute stress response in liver of Wistar rats // Physiol. Res. - 2010. - Vol. 59(5). - P. 729-736.
7. Kato K., Murakami H., Isozaki O. et al. Serum concentrations of BNP and ANP in patients with thyrotoxicosis // Endocr. J. - 2009. - Vol. 56(1). - P. 17-27.
8. Klecha A.J., Genaro A.M., Gorelik G. et al. Integrative study of hypothalamus-pituitary-thyroid-immune system interaction: thyroid hormone-mediated modulation of lymphocyte activity through the protein kinase C signaling pathway // J. Endocrinol. - 2006. - Vol. 189(1). - P. 45-55.
9. Pappas M., Mourouzis K., Karageorgiou H. et al. Thyroid hormone modulates the responsiveness of rat aorta to alpha1-adrenergic stimulation: an effect due to increased activation of beta2-adrenergic signaling // Int. Angiol. - 2009. - Vol. 28(6). - P. 474-478.
10. Rogausch H., Bock T., Voigt K.H., Besedovsky H. The sympathetic control of blood supply is different in the spleen and lymph nodes // Neuroimmunomodulation. - 2004. - Vol. 11 (1). - P. 58-64.

Рецензенты:

Косарева П.В., д.м.н., зав. морфологическим отделом ЦНИЛ ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава», г. Пермь;

Кузнецов В.Ф., д.м.н., профессор, зав. кафедрой нормальной физиологии ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава», г. Пермь.

Библиографическая ссылка