Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Выявление антител к вирусу гепатита С (анти-ВГС) в крови пациентов методом иммуноферметного анализа (ИФА), которое является первым шагом лабораторной диагностики ВГС-инфекции, наиболее эффективно при обследовании людей без иммунодефицитного состояния в фазу развернутой продукции антител. На раннем этапе заражения ВГС и после выздоровления [8], а также при патологических и физиологических, в частности, возрастных, иммунодефицитных состояниях результаты исследования анти-ВГС в ИФА могут быть позитивными, но с низкой оптической плотностью, или противоречивыми [6]. В то же время вследствие широкого распространения и социальной значимости ВГС-инфекции необходимость в правильной интерпретации результатов исследования возникает уже на этапе первичного скрининга. Развитие гепатита С сопровождается определенными биохимическими изменениями сыворотки крови, в частности, увеличением концентрации аланинаминотрансферазы и α-фетопротеина (АФП) [3, 9]. Некоторые из биохимических маркеров повреждения печени могут быть обнаружены в сыворотке крови с неопределенным результатом исследования анти-ВГС в иммуноблоте [5]. В РФ в качестве подтверждающих тест-систем используются не только иммуноблоты, но и тест-системы для ИФА (ИФТС) в планшетном формате с раздельным определением антител к ряду антигенов ВГС. Относительно биохимической характеристики сыворотки крови с неопределенным результатом исследования анти-ВГС в планшетных ИФТС в литературе имеются единичные данные [5].

Целью представленной работы было определение концентрации α-фетопротеина в сыворотке крови пациентов пожилого возраста с различным, в том числе неопределенным, результатом исследования анти-ВГС в подтверждающих тест-системах планшетного формата с раздельным определением антител к антигенам ВГС.

Материалы и методы

Результаты были получены при исследовании 82 образцов сыворотки крови пожилых людей, направленных на определение наличия в них маркеров вирусных гепатитов.

Определение анти-ВГС проводилось с помощью лицензированных ИФТС по двухэтапной схеме [4]. На первом этапе (при скрининге) была использована ИФТС «ВекторБест-анти-ВГС» (ЗАО «ВекторБест», г.Новосибирск) с комплексной сорбцией антигенов ВГС. На втором этапе (при подтверждении) были использованы две ИФТС с раздельной сорбцией Core и NS антигенов: «РекомбиБест анти-ВГС-подтверждающий тест» (ЗАО «ВекторБест», г. Новосибирск) и «ДС-ИФА-Анти-HCV-спектр GM», комплект 4 (ООО НПО «Диагностические системы», г. Н.-Новгород).

Позитивные образцы с низкой оптической плотностью в скрининге и в подтверждающей ИФТС согласно ранее разработанному алгоритму [7] были дополнительно исследованы в двух ИФТС с раздельной сорбцией четырех антигенов ВГС (Core, NS3, NS4 и NS5): «ДС-ИФА-Анти-HCV-спектр
GM», комплект 2, и ВекторБест-анти-ВГС-подтверждающий тест» (ЗАО «ВекторБест»), а также в линейном иммуноферментном анализе (ЛИА) «INNO-LIA HCV Ab III update» («Innogenetics», Бельгия). Определение авидности антител проводили с использованием ИФТС «ДС-ИФА-АНТИ-HCV-АВИДНОСТЬ», серия 3 (ООО НПО «Диагностические системы»). Для определения концентрации АФП был использован набор реагентов «АФП-ИФА-Бест-400-стрип» (ЗАО «Вектор-Бест»).

Значение коэффициента позитивности (КП) рассчитывали по отношению величины ОП контрольного образца к ОПкр. Статистическую обработку результатов проводили с помощью двух компьютерных программ: «Excel» и «Биостатистика» [1].

Полученные результаты

После исследования в образцах сыворотки крови наличия анти-ВГС были выделены следующие группы:

1) при отсутствии анти-ВГС в скрининговой тест-системе образцы были признаны не содержащими анти-ВГС (группа Анти-ВГС-);

2) при выявлении в первичной скрининговой и в подтверждающей тест-системе анти-ВГС с высокой оптической плотностью (ОП не менее 2,0, КП не менее 8) образцы были признаны анти-ВГС-содержащими (группа Анти-ВГС+).

Следующие две группы были выделены при дальнейшем исследовании позитивных образцов с низкой ОП в ИФТС для первичного скрининга (ОП менее 1,4, КП менее 5), а именно:

3) при выявлении анти-ВГС с низкой ОП и соответственно с низким КП в двух подтверждающих ИФТС разных производителей и определения низкой или высокой авидности анти-ВГС образцы признавались анти-ВГС-низкопозитивными (группа Анти-ВГС низк+);

4) при выявлении анти-ВГС только в одной из двух подтверждающих ТС либо при выявлении анти-ВГС в двух подтверждающих ТС разных производителей, но при отсутствии положительного результата в ЛИА и при определении авидности анти-ВГС, результат исследования анти-ВГС рассматривался как неопределенный в ИФТС, но отрицательный в ЛИА (группа Анти-ВГС но/-).

Группу Анти-ВГС- составили 16 образцов сыворотки крови пациентов (средний возраст 74,5 ± 7,45 лет), у которых отсутствовали указания на факторы высокого риска инфицирования ВГС. В группе анти-ВГС средняя величина концентрации АФП составляла 8,25 МЕ/мл (от 3,741 до 29,71 МЕ/мл, σ = 6,266 МЕ/мл).

Группу Анти-ВГС+ составили 30 образцов (средний возраст пациентов 73,6 ± 5,5 лет). Образец №8 был получен от пациента с заболеванием печени, образец №22 - от пациента с наркоманией. В 28 из 30 образцов в подтверждающей ТС были обнаружены анти-Core и анти-NS ВГС с ОП в первичной и подтверждающей ИФТС не менее 2, КП не менее 8. В образце №18 определялись только анти-Core с ОП 2,0 и КП 8,0, в образце №7 определялись только анти-NS с ОП 2,7 и КП 10,8. Во всех образцах данной группы анти-ВГС были высокоавидными. Средняя концентрация АФП в группе Анти-ВГС+ составляла 14,725 МЕ/мл (интервал от 3,804 до 111,815 МЕ/мл, σ = 22,02 МЕ/мл).

В группу Анти-ВГСнизк+ (11 образцов, средний возраст пациентов 71,5 ± 6,4 года) образцы были отобраны согласно ранее разработанному алгоритму: либо при обнаружении только анти-Core с КП менее 2; либо при обнаружении только анти-NS ВГС (табл. 1). Средняя величина КП анти-NS в каждой ИФТС не превышала 5, однако КП анти-NS в разных ИФТС могли отличаться (образец №2). В 8 из 11 образцов авидность анти-ВГС была высокой, в трех - низкой. В 6 из 11 образцов были обнаружены только высоко- или низкоавидные анти-NS4 ВГС. Указаний на наличие факторов высокого риска инфицирования ВГС не было ни у одного пациента. Среднее значение концентрации АФП в группе анти-ВГСнизк+ было равно 7,045 МЕ/мл (от 4,06 до 24,06 МЕ/мл; σ = 5,773 МЕ/мл).

Результаты исследования 25 образцов (средний возраст пациентов 75,4 ± 7,0 лет) в ИФТС планшетного формата были противоречивыми (табл. 2). Из 25 образцов в двух (№3 и №18) были обнаружены высокоавидные анти-ВГС, в шести образцах (№№ 1, 2, 6, 9, 16, 19) авидность анти-ВГС была низкой. Все вышеперечисленные образцы в ИФТС другого производителя и в ЛИА были определены как анти-ВГС-негативные (группа Анти-ВГСно/-). Средняя величина концентрации АФП в образцах Анти-ВГСно/- была равна 11,187 МЕ/мл (от 2,941 до 83,16 МЕ/мл, σ = 16,642 МЕ/мл).

При сравнении сывороточной концентрации АФП по критерию Манна-Уитни было обнаружено, что группа образцов, не содержащих анти-ВГС, не отличается ни от одной из исследованных групп. Различия по концентрации АФП были обнаружены:

1) между группами Анти-ВГС+ и Анти-ВГСнизк+ (p = 0,024);

2) между группами Анти-ВГС+ и Анти-ВГСно/- (p = 0,045).

Обсуждение и заключение

У пациентов пожилого возраста в г. Москве инфицирование вирусом гепатита С является наиболее частой причиной хронического гепатита (69,3% больных) [2]. При инфицировании ВГС в возрасте старше 50 лет цирроз печени формируется вдвое быстрее, чем у лиц, инфицированных до 50 лет. Осложнения ВГС-инфекции выявляются у пожилых в основном в далеко зашедших формах вследствие того, что длительная бессимптомная персистенция вируса и стертые клинические проявления заболевания приводят к позднему обращению больных к врачу [2]. Повышение специфичности лабораторной диагностики ВГС-инфекции как на раннем этапе инфицирования, так и при возрастной недостаточности иммунного ответа возможно при расширенных исследованиях анти-ВГС-позитивных образцов с низкой ОП в ИФА. Сравнивая результаты исследования проб пожилых людей с ранее полученными результатами исследования проб молодых мужчин [5], можно отметить следующее. Из общего количества образцов с неопределенными результатами исследования в ИФТС позитивными при дальнейшем исследовании признается не более 1/3 как в группе молодых мужчин, так и людей старше 65 лет. Различия между группами проявились, во-первых, в спектре выявляемых антител. В пробах, полученных от пожилых людей, в ИФТС с низкой ОП могли определяться анти-NS3, -NS4 и -NS5 раздельно и в различных сочетаниях; в ИБ/ЛИА наличие анти-ВГС в пробах данной подгруппы не подтверждалось. В пробах, полученных от молодых мужчин, практически во всех образцах с неопределенным результатом исследования анти-ВГС в ИФТС выявлялись только анти-NS4 ВГС; в дальнейших исследованиях в иммуноблоте наличие анти-ВГС не подтверждалось. Во-вторых, различие между группами выявилось по авидности антител: анти-NS4 у пожилых пациентов могли быть как высоко-, так и низкоавидными, а при обнаружении в пробе молодого пациента только анти-NS4 авидность антител не определялась. В-третьих, согласно нашим данным, изменение концентрации АФП в зависимости от результата тестирования анти-ВГС (позитивного, негативного и неопределенного) в группах проб молодых и пожилых пациентов было различным. Концентрация АФП в анти-ВГС-негативных образцах сыворотки крови молодых мужчин была ниже, чем в анти-ВГС-позитивных образцах и в образцах с неопределенными в ИФТС и неотрицательными в иммуноблоте результатами. В двух последних подгруппах концентрация АФП не различалась [5], что подтверждает вывод Rios [10] об эпидемиологической близости групп с анти-ВГС-позитивными и неопределенными результатами. В отличие от этого, группа образцов пожилых людей с отрицательными результатами тестирования анти-ВГС была крайне гетерогенной по концентрации АФП, по-видимому, вследствие разнообразных приобретенных заболеваний и наличия иных, кроме ВГС, гепатотоксических факторов, вследствие чего не отличалась ни от одной из исследованных групп по концентрации АФП. Отмеченное превышение сывороточной концентрации АФП в анти-ВГС-высокопозитивных образцах над концентрацией АФП в анти-ВГС-низкопозитивных образцах может быть обусловлено длительностью инфекционного процесса, в течение которого наиболее выраженное повышение уровня АФП наблюдается на стадии тяжелого фиброза с последующим снижением при трансформации в цирроз печени (частом осложнении хронического гепатита С у пожилых людей) [3]. Кроме того, в низкопозитивных на наличие анти-ВГС-образцах отсутствие подъема концентрации АФП может быть обусловлено начальным этапом инфекционного процесса (с анти-ВГС низкой авидности) либо выздоровлением (с остаточными анти-ВГС высокой авидности) с нормализацией биохимических показателей. Образцы с противоречивыми в ИФТС, но отрицательными в иммуноблоте и в тесте на авидность результатами, по-видимому, проявляли в ИФТС ложную позитивность.

Таблица 1

Концентрация α-фетопротеина в образцах сыворотки крови пожилых людей,
содержащих высоко- и низкоавидные анти-ВГС (соответственно ВА и НА)
с низким коэффициентом позитивности (значение КП указано).

ИФТС1 («РекомбиБест анти-ВГС-подтверждающий тест») и ИФТС2
(«ДС-ИФА-Анти-HCV-спектр GM» комплект 4) - подтверждающие тест-системы с раздельным определением анти-Core и анти-NS ВГС.

ИФТС3 («ДС-ИФА-Анти-HCV-спектр GM» комплект 2) - подтверждающая тест-система с раздельным определением анти-Core, анти-NS3, анти-NS4, анти-NS5 ВГС

Таблица 2

Концентрация α-фетопротеина в образцах сыворотки крови пожилых людей
с неопределенным результатом исследования анти-ВГС в ИФТС и отрицательным
в ЛИА. *ИФТС1, ИФТС2, ИФТС3-см. в табл. 1. **Авидность: ВА - высокая,
НА - низкая, НО -не определяется

В заключение следует отметить, что, в отличие от молодых мужчин, в группе пожилых людей повышенная концентрация АФП не может служить дополнительным критерием, позволяющим рассматривать группу с неопределенными в ИФТС результатами как группу, эпидемиологически близкую к группе с анти-ВГС-позитивными результатами. Таким образом, в лабораторной диагностике гепатита С необходима комплексная оценка серологических и биохимических маркеров ВГС-инфекции с учетом возрастной категории пациента.

Список литературы

1. Гланц С. Медико-биологическая статистика. - М.: Практика, 1999. - 321 с.
2. Дьякова И.П. Особенности клинической картины и лечения HCV-инфекции у пожилых: автореф. дис. ... канд. мед. наук. - М., 2005. - 26 с.
3. Клиническое значение онкологических маркеров при хроническом гепатите С / Ю.В. Лобзин, К.В. Жданов, Д.А. Гусев, В.Л. Пастушенков, А.В. Шкуро // Медицинский академический журнал. - 2005. - №1. - С. 67-73.
4. О применении в практике здравоохранения иммуноферментных тест-систем для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) и антител к вирусу гепатита С (анти-ВГС) в сыворотке крови человека. Приказ МЗ РФ № 322 от 21.10.2002.
5. Потапова А.А. Концентрация альфа-фетопротеина в сыворотке крови с неопределенным результатом исследования антител к вирусу гепатита С в иммуноферментном анализе // Росс. иммунол. журнал. - 2010. - Т. 4, №13. - С. 173-181.
6. Возрастной аспект лабораторной диагностики вирусного гепатита С / А.А. Потапова, П.Г. Богуш, Е.Б. Редченко, Э.Ю. Сариди, Е.Ю. Варламова. // Клиническая геронтология. - 2006. - Т. 12, №3. - С. 41-45.
7. Потапова А. А., Редченко Е. Б., Науменко В.А. Алгоритм исследования «проблемных» образцов при массовом скрининге сыворотки крови на антитела к вирусу гепатита С // Мир вирусных гепатитов. - 2008. - №4. - С. 8-12.
8. Alter M.J., Kuhnert W.L., Finelli L. Laboratory Testing and Result Reporting of Antibody to Hepatitis C Virus Guidelines for Laboratory Testing and Result Reporting of Antibody to Hepatitis C Virus // MMWR Recomm. Rep. -2003. - Vol. 52 (RR-3). - P. 1-13.
9. Caspari G., Gerlich W.H., Beyer J., Schmitt H. Non-specific and specific anti-HCV results correlated to age, sex, transaminase, rhesus blood group and follow-up in blood donors // Arch. Virol. -1997. - Vol. 142, №3. -P. 473-489.
10. Rios M., Diago M., Rivera P., Tuset C., Cors R. et al. Epidemiological, biological and histological characterization of patients with indeterminate third-generation recombinant immunoblot assay antibody results for hepatitis C virus // J.Viral. Hepat.. -2006. - Vol.13, №3. - P. 177-181.

Рецензенты:

Захарова Л.А., д.б.н., профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории гистогенеза Учреждения РАН Института биологии развития им. Н.К. Кольцова, Москва;

Козлов И.Г., д.м.н. профессор, зав. кафедрой фармакологии ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава», Москва.