Введение. Селезенка - это основной орган, элиминирующий микроорганизмы из кровотока. Экстирпация ее и операционный стресс увеличивают нагрузку на оставшуюся часть периферической иммунной системы по удалению из кровяного русла различных антигенов, что ведет к нарушениям резистентности организма. После спленэктомии происходит целый комплекс процессов, резко изменяющих не только иммунную резистентность организма, но и систем гемостаза и гемопоэза, что проявляется в развитии различных осложнений [5, 7]. Селезенка относится к периферическим лимфоидным органам. В ней концентрируются супрессорные, хелперные и часть эффекторных клеток, здесь же происходит процесс активного антителообразования и продукция гуморальных медиаторов [3]. В селезенке содержится приблизительно 25 % лимфоцитов типа Т и около 60 % лимфоцитов типа В [2]. В ней протекают оба этапа дифференцировки антителообразующих клеток из костномозговых предшественников, в то время как для Т-лимфоцитов антигеннезависимый этап дифференцировки из костномозговых предшественников осуществляется в тимусе, а антигензависимый - в селезенке [8, 9, 10]. Сложное строение лимфатических фолликулов селезенки, включающих тимусзависимые, тимуснезависимые и макрофагальные элементы, создает благоприятные условия в органе для кооперации клеток в иммунном ответе [1]. Известно, что удаление селезенки приводит к потере ряда функций, связанных с иммунной защитой [6]. Однако механизм этих изменений до конца не изучен.
Цель исследования: оценка особенностей нарушения функции Th1-, Th2-лимфоцитов (Т-хелперов первого и второго типов) и редукции продуцируемых ими цитокинов (ИФН-γ, ИЛ-4) в формировании супрессии гуморальных и клеточных реакций после удаления селезенки.
Материалы и методы
Исследования проводились на 762 неинбредных белых крысах обоего пола, крысах популяции Wistar и на 77 беспородных белых мышах обоего пола, а также на мышах линии СВА. Масса крыс и мышей составляла соответственно 180‒240 и 18‒22 г.
В соответствии со стандартами Этического комитета все оперативные вмешательства и эвтаназия производились при обезболивании. Спленэктомию проводили при верхней срединной лапаротомии, с последующим выведением селезенки на желудочно-селезеночной связке через операционную рану. На селезеночную вену, артерию и некоторые ее ветви (короткие артерии желудка, сальниковые и поджелудочные ветви) накладывались двойные лигатуры, между которыми производилось пересечение сосудов. Затем пересекались связки селезенки и она удалялась. Операционная рана ушивалась послойно хирургическим шелком и обрабатывалась 5 %-м спиртовым раствором йода. Аналогичным способом у контрольных животных проводились ложные операции с имитацией удаления селезенки.
Показатели системы иммунитета оценивали общепринятыми методами в экспериментальной иммунологии [4]. Гуморальную иммунную реакцию к тимусзависимым эритроцитам барана (ЭБ) определяли на 6-е сутки после удаления селезенки по числу антителообразующих клеток (АОК) после спленэктомии с одновременной внутрибрюшной иммунизацией крыс данными антигенами в дозах 2⋅108 клеток. В используемом тесте гуморальная иммунная реакция на введение ЭБ характеризует способность Th1-лимфоцитов участвовать в продукции В-лимфоцитами (плазматическими клетками) IgM. ОАК к ЭБ, синтезирующие IgG, определяли методом непрямого локального гемолиза в геле через 7 суток. Данные литературы позволяют полагать, что такой метод характеризует преимущественно функцию Th2-лимфоцитов, обеспечивающих синтез IgG1, составляющих около 70 % общего числа молекул этого класса.
Активность естественных клеток-киллеров (ЕКК), существенное влияние на которые оказывает ИЛ-2, продуцируемый Th1-типа, определяли по показателю естественной цитотоксичности (ЕЦ) спектрометрически. Формирование гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), характеризующую функцию Th1-лимфоцитов, исследовали у животных по приросту массы стопы задней лапы в %, при этом крыс внутрибрюшинно иммунизировали 108 ЭБ через 30 минут после операции. Разрешающую дозу ЭБ (5⋅108) вводили под апоневроз стопы задней лапы через 4 суток. Реакцию ГЗТ оценивали через 24 часа. Для оценки изменения функции лимфоцитов Th1- Th2-типов после спленэктомии с исследованием иммунных реакций определяли концентрацию продуцируемых ими цитокинов (соответственно ИФН-γ и ИЛ-4) в периферической крови крыс через 4 и 7 суток после иммунизации методом ферментного иммуносорбертного анализа (ELISA), используя наборы (ELISA Kits) фирмы BioSourcr Int.
Статистическая обработка полученных данных проводилась при помощи непараметрического метода U-критерия теста Mann‒Whitney (пакет программ Statistica 6.0).
Результаты и их обсуждение
В результате проведенных исследований установлено, что в группе животных после спленэктомии через 4 суток происходил гуморальный ответ к Т-зависимому антигену, характеризующему синтез IgM и функцию Th1-лимфоцитов, по сравнению с контрольным уровнем в 1,63 раза (p < 0,05), а через 7 суток отмечалась супрессия продукции IgG, отражающая преимущественно функцию Th2-лимфоцитов в 1,43 раза (p < 0,05). Кроме того, в группе животных после спленэктомии зарегистрирована существенная редукция активности ЕКК, зависящая от функции лимфоцитов Th1-типа в 1,47 раза (p < 0,05) реакция ГЗТ, отражающая функцию Th1-клеток и макрофагов в 1,44 раза (p < 0,05).
Показатели, характеризующие различные иммунные реакции и связанную с ними функцию Th1- и Th2-лимфоцитов, после спленэктомии снижались в среднем в 1,53 и 1,46 раза соответственно. Это свидетельствует о том, что удаление селезенки практически в равной степени нарушает функцию Th1- и Th2-лимфоцитов.
Данное заключение подтверждается исследованием концентрации цитокинов в периферической крови крыс, представленные в таблице.
Из данных, представленных в таблице, видно, что в группе животных с удаленной селезенкой отмечается уменьшение концентрации ИФН-γ и ИЛ-4 на пятые сутки соответственно в 1,27 и 1,38 раза (p < 0,05), а через семь суток ‒ в 1,33 и 1,40 раза соответственно (p < 0,05). Из этого можно сделать заключение, что удаление селезенки приводит к уменьшению ИФН-γ и ИЛ-4 в равной степени.
Влияние спленэктомии на содержание цитокинов
в периферической крови крыс (M ± m)
|
Серии опытов |
Время исследования после иммунизации, сут |
Исследуемый показатель |
||
|
ИФН-γ |
ИЛ-4 |
ИФН-γ/ИЛ-4 |
||
|
Контроль (n = 8) |
867 ± 0,2 |
120 ± 0,2 |
7,3 |
|
|
Спленэктомия (n = 10) |
5 |
681 ± 0,1* |
90 ± 0,5* |
7,6 |
|
8 |
628 ± 0,3* |
86 ± 0,6* |
7,3 |
|
Примечание: * - знак статистической достоверности (p < 0,05) по сравнению с контролем
Как уже указывалось, ИФН-γ продуцируют Th1-лимфоциты, а ИЛ-4 - Th2-лимфоциты. Увеличение соотношения ИФН-γ/ИЛ-4 характеризует снижение функциональной активности лимфоцитов Th2-типа по сравнению с функцией Th1-клеток, а уменьшение данного соотношения свидетельствует о большей редукции активности лимфоцитов Th1-лимфоцитов по сравнению с Th2-клетками. В результате проведенных исследований установлено, что соотношение ИФН-γ/ИЛ-4 после удаления селезенки составило на пятые и восьмые сутки соответственно 7,6 и 7,3 (контроль 7,2). Это подтверждает результаты, свидетельствующие о снижении Th1- и Th2-клеток после спленэктомии в равной степени.
Таким образом, представленные данные показывают, что селезенке принадлежит важная роль в гуморальных и клеточных реакциях, и ее удаление приводит к снижению продукции Th1- и Th2-лимфоцитов и, как следствие, снижению показателей ИФН-γ и ИЛ-4 в организме исследуемых животных. При этом иммунные реакции, связанные с функцией Th1- и Th2-лимфоцитов, после спленэктомии редуцируются в равной степени.
Список литературы
- Агеев А.К. Т- и В-лимфоциты: распределение в организме, функционально-морфологическая характеристика и значение // Архив патол. - 1976. - № 12. - С. 3-11.
- Барта И. Селезенка. - М.: Медицина, 1976.
- Виноградов В.В. Гетеротопическая аутолиентрансплантация селезеночной ткани после спленэктомии / В.В. Виноградов, В.И. Денисенко // Хирургия. - 1986. - № 2.
- Забродский П.Ф. Иммунотоксикология ксенобиотиков: монография / П.Ф. Забродский, В.Г. Мандыч. - Саратов: СВИБХБ, 2007. - С. 420.
- Лебедев Н.В. Диагностика повреждений живота при сочетанной травме / Н.В. Лебедев, М.М. Абакумов, В.И. Малярчук // Хирургия. - 2002. - № 12. - С. 53-58.
- Шапкин Ю.Г. Селезенка и иммунный статус организма / Ю.Г. Шапкин, В.В. Масляков // Вестник хирургии. - 2009. - № 2.
- Юнга М.А. Релапаротомия при травмах живота / М.А. Юнга, Е.А. Юрмин, Е.Н. Лабай // Вестн. хирургии им. И.И. Грекова. - 1985. - № 6. - С. 94-97.
- Musavi M. Function of splenic omental implants in man after traumatic rupture of the spleen / M. Musavi, H.A. Dayem, A. Whitl // The 32 nd World Congress of Surgery. - Sidney, 2007.
- Okita K. Effect of splenectomy in tumor-beaking and gastric cancer patients / K. Okita, K. Komaga, K. Okaja // Gann. - 2007. - Vol. 680.
- Vobofil Z. Segmntare resktion der verletzter humanmils / Z. Vobofil // Chirurg. - 1982. - Bd. 53. - № 11.
Рецензенты:
Гермашев А.Г., д.м.н., профессор кафедры экологии безопасности жизнедеятельности Саратовского государственного социально-экономического университета;
Клинов А.Н., к.б.н., доцент кафедры экологии безопасности жизнедеятельности Саратовского государственного социально-экономического университета.