Проблема лечения гепатитов различной этиологии является чрезвычайно актуальной. Несмотря на большой арсенал гепатопротекторов, клиницистам не всегда удается добиться стабилизации течения гепатита, повышения регенераторной активности и предотвращения развития фиброза и цирроза печени [8]. В связи с этим продолжаются поиски новых лекарственных агентов, в том числе и растительного происхождения, обладающих широким спектром фармакологической активности и экономической доступностью. Объектом нашего внимания длительное время является производное бетулоновой кислоты - ее аланинамид (АБК). Ранее нами было показано, что этот агент обладает антиоксидантным, противоопухолевым, гемато-, кардио-, нефро- и гепатопротекторным действием в условиях цитостатического воздействия [1-6, 9]. Кроме того, на модели острого токсического гепатита было показано, что введение животным АБК способствует нормализации биохимических показателей крови [10, 11]. Поэтому для дальнейшего расширения фармакологического спектра действия данного агента проведены исследования его влияния на процессы фиброгенеза и формирования цирроза печени в длительном эксперименте.
Цель работы - изучение влияния АБК на биохимические показатели крови, популяционную динамику гепатоцитов и морфологию печени крыс при хроническом токсическом поражении четыреххлористым углеродом в сочетании с этанолом.
Материал и методы исследования
Эксперимент выполнен на 45 белых лабораторных крысах-самках массой 178 г, полученных из вивария Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск), содержавшихся в стандартных условиях на обычном пищевом и водном рационе. Манипуляции с животными проводились согласно Женевской Конвенции 1986 г.
Токсические повреждения печени моделировали путем внутрижелудочного введения четыреххлористого углерода (CCl4) в дозе 0,1 мл/кг в растворе растительного масла (0,3 мл/100 г) трижды в неделю, в сочетании с 5%-м раствором этанола в качестве питья в свободном доступе на протяжении 6 нед. Все животные были разделены на 3 группы по 15 особей в каждой. Животные I группы получали только CCl4 и этанол; крысы II группы - те же токсические агенты и АБК в дозе 50 мг/кг в водно-твиновом растворе, который вводили ежедневно внутрижелудочно со 2-й по 6-ю неделю эксперимента включительно (две последующие недели были восстановительным периодом); III группа - интактные животные. Из опыта крыс выводили декапитацией через 3, 6 и 8 нед. В сыворотке крови определяли активность АЛТ, АСТ, ЩФ, ЛДГ, уровень общего белка, прямого билирубина и глюкозы.
Для оценки популяции гепатоцитов была проведена щелочная диссоциация печени [3]. Клеточную суспензию окрашивали 30 мин 1%-м раствором орсеина на 70%-й уксусной кислоте, разводили дистиллированной водой до концентрации 5 мг/мл. Подсчет ядер гепатоцитов из одного образца ткани проводили в 6 последовательно заполняемых суспензией камерах Горяева. Рассчитывали число ядер гепатоцитов в 1 мг ткани (n), абсолютное число гепатоцитов (М), индекс двуядерных гепатоцитов (M2/M·100).
Для гистологического исследования образцы печени заключали в парафин по общепринятой методике, изготавливали парафиновые срезы толщиной 4 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином на гистологическом комплексе «MICROM» (Карл Цейс) и по методу Маллори. Исследование проводили с помощью микроскопа Axioskop 40.
Количественные данные обрабатывали методами параметрической статистики с использованием пакета программ «Microsoft Excel». Результаты считали достоверными при p < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Через 3 нед. воздействия CCl4 и этанола у животных I группы повысилась активность ферментов АЛТ, АСТ, ЩФ, ЛДГ соответственно на 94, 141, 83 и 134% по сравнению с интактным контролем (III группа) (табл. 1). Через 6 нед. эксперимента значительно возросли уровни ферментов АСТ, ЩФ по сравнению с 3-й неделей (соответственно на 27 и 89%), а с аналогичными показателями интактного контроля - до 200%. Активность ферментов АЛТ и ЛДГ через 6 нед. эксперимента оставалась на прежнем уровне. В течение восстановительного периода у животных I группы уровни АЛТ и ЛДГ оставались значительно повышенными по сравнению с аналогичными показателями интактного контроля (см. табл. 1). С помощью метода щелочной диссоциации у животных I группы выявлено уменьшение на 70% концентрации ядер гепатоцитов и их абсолютной численности. Двуядерные гепатоциты составили 0,87% от всей популяции клеток паренхимы (табл. 2), что свидетельствовало о низком уровне регенерации (в интактном контроле доля двуядерных гепатоцитов равнялась 14,5%) (см. табл. 2). Через 6 нед. концентрация ядер гепатоцитов, их абсолютное число и популяция двухдерных гепатоцитов оставались без существенной динамики. В течение восстановительного периода происходило увеличение концентрации ядер, абсолютного числа гепатоцитов и популяции двуядерных клеток (см. табл. 2), что, возможно, связано с включением естественных механизмов регенерации.
При светооптическом исследовании печени у животных I группы через 3 нед. эксперимента определялись следующие типы поражения гепатоцитов: диффузная мелко- и крупновезикулярная липидная инфильтрация, гидропическая дистрофия, являющиеся маркерами токсического и алкогольного воздействия [7]. Крупные капли липидов оттесняли на периферию ядра клеток, которые принимают перстневидную форму. В части гепатоцитов отмечалось слияние капель жира, что сопровождалось некрозом клеток и формированием внеклеточных жировых кист. Мелкоочаговые некрозы гепатоцитов локализовались в перипортальных и центролобулярных зонах, по их периферии регистрировалась лимфоцитарная инфильтрация; фиброз развивался по периферии печеночных балок. Синусоиды были заполнены фибрином и некротизированными гепатоцитами. Перипортально отмечалось большое количество сидерофагов. К 6-й неделе эксперимента у всех животных наблюдалось развитие портопортального и портоцентрального фиброза с пролиферацией желчных капилляров и прогрессированием к 8-й неделе в цирроз смешанного типа (крупно- и мелкоузловой). На основании этого можно сделать вывод о развитии у всех животных тяжелого токсического поражения печени с исходом в цирроз смешанного типа.
При введении животным АБК (II группа) выявлена положительная динамика изменений активности ферментов. Через 3 нед. эксперимента уровни АЛТ и АСТ были снижены на 42% по сравнению с I группой. Уровни ЩФ и ЛДГ были существенно ниже, чем в I группе, но превышали эти значения соответственно на 11 и 103% по сравнению с интактным контролем (см. табл. 1). Через 6 нед. отмечалось дальнейшее снижение уровней ферментов АСТ, АЛТ, ЩФ по сравнению с I группой, лишь значения ЛДГ оставались повышенными (см. табл. 1). У животных, получавших АБК, через 8 нед. наблюдалось восстановление до нормы уровня прямого билирубина, активности ЩФ, ЛДГ и АЛТ (см. табл. 1). Концентрация ядер гепатоцитов и их абсолютное число существенно увеличились лишь через 6 нед. (соответственно на 7 и 54%) (см. табл. 2). Доля двуядерных гепатоцитов через 3 и 6 нед. эксперимента достоверно не отличалась от таковой в I группе (см. табл. 2). Через 8 нед. отмечен рост популяции двуядерных гепатоцитов в данной группе до 7,1%, тогда как в I группе (воздействие CCl4 и этанола) этот показатель составил всего 1,8% (см. табл. 2). Увеличение концентрации ядер и абсолютного числа гепатоцитов на фоне применения АБК свидетельствовало о стимуляции регенераторной способности печени.
Таблица 1
Влияние аланинамида бетулоновой кислоты на биохимические показатели крови крыс на фоне токсического гепатита (M±m)
|
Экспериментальная группа |
Срок эксперимента (нед) |
Общий белок, г/л |
Билирубин прямой, мкмоль/л |
Глюкоза, моль/л |
АЛТ, Ед/л |
АСТ, Ед/л |
ЩФ, Ед/л |
ЛДГ, Ед/л |
|
I группа - введение ССl4 |
3 |
87,5±12,2* |
21,3±10,9 |
5,6±0,3 |
216,6±41,3** |
400,4±151,3* |
719,8±232,7* |
1460,3±184** |
|
6 |
97,02±5,9** |
13,97±6,0 |
5,0 ±0,9* |
202,35±41,0** |
508,3±85,2** |
1356,0±465,2** |
1336,5±101,6** |
|
|
8 |
98,32±8,1** |
2,75±1,2** |
6,9 ±0,3* |
221,97±22,6** |
296,9±29,9** |
940,2±105,3** |
1845,3±259,7** |
|
|
II группа - введение аланинамида бетулоновой кислоты |
3 |
82,0±8,4 |
11,6±2,4 |
6,0±0,3 |
128,3±11,7## |
233,8±27,4 |
435,0±49,3# |
1266,1±57,4 |
|
6 |
85,5±7,4# |
20,7±1,5# |
8,5±0,5## |
78,9±5,5## |
164,9±8,4## |
317,6±26,7## |
1414,0±68,4 |
|
|
8 |
103,6±7,9 |
5,8±1,8## |
5,2±0,4## |
107,7±15,4## |
217,7±20,7## |
285,5±32,2## |
583,3±113,3## |
|
|
III группа - интактный контроль |
8 |
64,8±2,2 |
8,9±3,04 |
6,2±0,4 |
111,4±11,7 |
165,9±27,2 |
393,2±83,0 |
623,5±230,9 |
Примечание.
*; ** - p ≤ 0,05; p ≤ 0,01 - при сравнении с интактным контролем;
#; ## - p ≤ 0,05; p ≤ 0,01 - при сравнении с введением CCl4.
Таблица 2
Влияние аланинамида бетулоновой кислоты на популяционную динамику гепатоцитов при токсическом гепатите (M±m)
|
Экспериментальная группа |
Срок эксперимента (нед) |
Число ядер гепатоцитов в 1 мг ткани (∙103) |
Абсолютное число ядер гепатоцитов (∙106) |
Абсолютное число гепатоцитов (∙106) |
Абсолютное число одноядерных гепатоцитов (∙106) |
Абсолютное число двуядерных гепатоцитов (∙106) |
|
I группа - введение ССl4 |
3 |
35,1±0,7** |
398,4±32,1** |
394,9±33,5** |
391,5±34,8 |
3,4±1,5 |
|
6 |
64,7±3,6** |
486,2±94,3** |
466,1±89,8** |
445,9±85,6 |
20,1±6,9 |
|
|
8 |
44,8±7,6** |
595,1±116,9** |
584,0±115,9** |
573±115,0 |
11,0±3,7 |
|
|
II группа - введение аланинамида бетулоновой кислоты |
3 |
43,04±3,4## |
404,7±38,1 |
400,4±38,89 |
396,0±39,7 |
4,3±1,8 |
|
6 |
66,6±4,9 |
742,2±81,7## |
719,1±77,4## |
696,0±73,8 |
23,1±8,1 |
|
|
8 |
81,34±6,4## |
745,2±54,5# |
695,5±49,2 |
645,7±44,7 |
49,8±8,0 |
|
|
III группа -интактный контроль |
8 |
115,7+4,70 |
1252,8+49,3 |
1093,9+45,7 |
935,0+42,7 |
158,9+6,00 |
Примечание.
*; ** - p ≤ 0,05; p ≤ 0,01 - при сравнении с интактным контролем;
#; ## - p ≤ 0,05; p ≤ 0,01 - при сравнении с введением CCl4.
При световой микроскопии у животных на фоне введения АБК отмечалась положительная динамика морфологических изменений печени на всех этапах эксперимента (3, 6, 8 нед.). В гепатоцитах выявлялась очаговая гидропическая, клеточно-инволютивная дистрофия и лишь у отдельных животных - очаговая мелковезикулярная липидная инфильтрация. На 3-й неделе эксперимента фиброзная ткань локализовалась преимущественно перипортально и в виде тонких портопортальных тяжей. В просвете синусоидов выявлялись скопления купферовских клеток. Через 6 и 8 нед. эксперимента признаки фиброза, цирроза и перестройки печеночных балок не выявлены.
Заключение
При длительном энтеральном применении АБК купирует признаки как холестаза, так и цитолиза, увеличивает регенераторный потенциал гепатоцитов, полностью предотвращает развитие фиброза и цирроза печени при токсическом воздействии CCl4 и этанола. Полученные результаты расширяют спектр фармакологической активности агента и позволяют рекомендовать АБК для дальнейшего исследования в качестве высокоактивного гепатопротектора.
Рецензенты:
-
Поляков Л.М., д.м.н., профессор, зав. лабораторией медицинской биотехнологии и зам. директора по научной работе Научно-исследовательского института биохимии Сибирского отделения РАМН, г. Новосибирск;
-
Любарский М.С., д.м.н., зав. отделом клинической морфологии и заместитель директора по научной работе Научно-исследовательского института клинической и экспериментальной лимфологии Сибирского отделения РАМН, г. Новосибирск.
Работа поступила в редакцию 30.03.2012.