Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,252

БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ И КОЛИЧЕСТВО ГЕПАТОЦИТОВ В ПЕЧЕНИ КРЫС С ТОКСИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ ПРИ ДЕЙСТВИИ АЛАНИНАМИДА БЕТУЛОНОВОЙ КИСЛОТЫ

Толстикова Т.Г. 1 Жукова Н.А. 1 Семенов Д.Е. 2 Бессергенева Е.П. 1 Сорокина И.В. 3 Баев Д.С. 1 Глухов Б.М. 2
1 ФГБУН «Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова» СО РАН, Новосибирск
2 ФГБУ «Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН, Новосибирск
3 ФГБУН «Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова» СО РАН, Новосибирск
Изучено влияние аланинамида бетулоновой кислоты на биохимические показатели крови, численность гепатоцитов и морфологию печени крыс при хроническом токсическом поражении четыреххлористым углеродом в сочетании с этанолом. Через 8 нед. токсического воздействия у животных в крови повысилась активность ферментов АЛТ, АСТ, ЩФ, ЛДГ соответственно на 94, 141, 83 и 134%. Концентрация ядер гепатоцитов и их абсолютное число уменьшились на 70%, двухъядерные гепатоциты составили 0,87% популяции. К 6-й неделе происходило развитие фиброза с пролиферацией желчных капилляров с прогрессированием к 8-й неделе в цирроз. При введении животным аланинамида бетулоновой кислоты через 8 нед. уровень прямого билирубина, активности ЩФ, ЛДГ и АЛТ существенно не отличались от контроля; популяция двухъядерных гепатоцитов возрастала до 7,1%, признаки фиброза, цирроза и перестройки печеночных балок не выявлялись. Аланинамид бетулоновой кислоты при энтеральном применении купирует признаки холестаза и цитолиза, увеличивает регенераторный потенциал, полностью предотвращает развитие фиброза и цирроза печени.
хронический гепатит
фиброз печени
аланинамид бетулоновой кислоты
биохимические показатели крови
щелочная диссоциация клеток печени
1. Эффективность бетулоновой кислоты и ее аланинамидных производных при восстановлении паренхимы печени крыс в постцитостатический период / О.Р. Грек, С.В. Позднякова, А.П. Надеев, В.С. Пронин, Н.А. Жукова, И.В. Сорокина, Е.Б. Волкова, Т.Г. Толстикова // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2005. – Т. 68, № 6. – С. 49–51.
2. Влияние бетулоновой кислоты и ее производного [3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3-аминопропионовой кислоты на структуру печени мышей с лимфосаркомой RLS / Н.А. Жукова, Д.Е. Семенов, И.В. Сорокина, Т.Г. Толстикова, С.В. Позднякова, Грек О.Р. // Бюл. экспер. биол. – 2005. – Т. 140, № 9. – С. 348–350.
3. Влияние производных бетулина на структуру почки при лимфоме RLS / Н.А. Жукова, Д.Е. Семенов, И.В. Сорокина, Т.Г. Толстикова, С.В. Позднякова, О.Р. Грек // Сиб. науч. вестн. – 2006. – Вып. XI. – С. 49–51.
4. Морфологические изменения печени животных с перевитой карциномой легких Lewis при коррекции бетулоновой кислотой и её производными / Н.А. Жукова, И.В. Сорокина, Т.Г. Толстикова, Д.Е. Семенов // Бюл. Сибирского отд. РАМН. – 2008. – № 6. – С. 113–118.
5. Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию почек животных с перевитой карциномой легких Льюис на фоне полихимиотерапии и без ее воздействия / Н.А. Жукова, И.В. Сорокина, Т.Г. Толстикова, М.П. Долгих, Д.Е. Семенов // Химия в интересах устойчивого развития. – 2010. – Т. 18, № 4. – С. 483–488.
6. Структура печени мышей с перевитой карциномой легких Льюис при полихиомиотерапии и коррекции бетулоновой кислотой и ее производными / Н.А. Жукова, И.В. Сорокина, Т.Г. Толстикова, Е.Л. Лушникова, Л.М. Непомнящих, Д.Е. Семенов // Бюл. экспер. биол. – 2010. – Т. 150, № 7. – С. 108–112.
7. Непомнящих Д.Л., Айдагулова С.В., Непомнящих Г.И. Биопсия печени: патоморфогенез хронического гепатита и цирроза. – М.: Изд-во РАМН, 2006. – 367 с.
8. Оковитый С.В. Клиническая фармакология гепатопротекторов // Фарминдекс Практик. Гепатология. – 2002. – Вып. 3. – С. 34–42.
9. Изучение влияния бетулоновой кислоты и ее амидных производных на рост и метастазирование перевиваемых опухолей у мышей / И.В. Сорокина, Н.А. Жукова, Т.Г. Толстикова, С.В. Позднякова, О.Р. Грек, Н.А. Попова, В.И. Каледин, В.П. Николин // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 2006. – № 1. – С. 29–31.
10. Терпеноиды ряда лупана как перспективные для медицины биологически активные агенты. Часть 1. Нативные производные лупана / Т.Г. Толстикова, И.В. Сорокина, Г.А. Толстиков, А.Г. Толстиков, О.Б. Флехтер // Биоорганическая химия. – 2006. – Т. 32, № 1. – С. 42–55.
11. Терпеноиды ряда лупана как перспективные для медицины биологически активные агенты. Часть 2. Полусинтетические производные лупана / Т.Г. Толстикова, И.В. Сорокина, Г.А. Толстиков, А.Г. Толстиков, О.Б. Флехтер //
Биоорганическая химия. – 2006. – № 3. – С. 291–307.

Проблема лечения гепатитов различной этиологии является чрезвычайно актуальной. Несмотря на большой арсенал гепатопротекторов, клиницистам не всегда удается добиться стабилизации течения гепатита, повышения регенераторной активности и предотвращения развития фиброза и цирроза печени [8]. В связи с этим продолжаются поиски новых лекарственных агентов, в том числе и растительного происхождения, обладающих широким спектром фармакологической активности и экономической доступностью. Объектом нашего внимания длительное время является производное бетулоновой кислоты - ее аланинамид (АБК). Ранее нами было показано, что этот агент обладает антиоксидантным, противоопухолевым, гемато-, кардио-, нефро- и гепатопротекторным действием в условиях цитостатического воздействия [1-6, 9]. Кроме того, на модели острого токсического гепатита было показано, что введение животным АБК способствует нормализации биохимических показателей крови [10, 11]. Поэтому для дальнейшего расширения фармакологического спектра действия данного агента проведены исследования его влияния на процессы фиброгенеза и формирования цирроза печени в длительном эксперименте.

Цель работы - изучение влияния АБК на биохимические показатели крови, популяционную динамику гепатоцитов и морфологию печени крыс при хроническом токсическом поражении четыреххлористым углеродом в сочетании с этанолом.

Материал и методы исследования

Эксперимент выполнен на 45 белых лабораторных крысах-самках массой 178 г, полученных из вивария Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск), содержавшихся в стандартных условиях на обычном пищевом и водном рационе. Манипуляции с животными проводились согласно Женевской Конвенции 1986 г.

Токсические повреждения печени моделировали путем внутрижелудочного введения четыреххлористого углерода (CCl4) в дозе 0,1 мл/кг в растворе растительного масла (0,3 мл/100 г) трижды в неделю, в сочетании с 5%-м раствором этанола в качестве питья в свободном доступе на протяжении 6 нед. Все животные были разделены на 3 группы по 15 особей в каждой. Животные I группы получали только CCl4 и этанол; крысы II группы - те же токсические агенты и АБК в дозе 50 мг/кг в водно-твиновом растворе, который вводили ежедневно внутрижелудочно со 2-й по 6-ю неделю эксперимента включительно (две последующие недели были восстановительным периодом); III группа - интактные животные. Из опыта крыс выводили декапитацией через 3, 6 и 8 нед. В сыворотке крови определяли активность АЛТ, АСТ, ЩФ, ЛДГ, уровень общего белка, прямого билирубина и глюкозы.

Для оценки популяции гепатоцитов была проведена щелочная диссоциация печени [3]. Клеточную суспензию окрашивали 30 мин 1%-м раствором орсеина на 70%-й уксусной кислоте, разводили дистиллированной водой до концентрации 5 мг/мл. Подсчет ядер гепатоцитов из одного образца ткани проводили в 6 последовательно заполняемых суспензией камерах Горяева. Рассчитывали число ядер гепатоцитов в 1 мг ткани (n), абсолютное число гепатоцитов (М), индекс двуядерных гепатоцитов (M2/M·100).

Для гистологического исследования образцы печени заключали в парафин по общепринятой методике, изготавливали парафиновые срезы толщиной 4 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином на гистологическом комплексе «MICROM» (Карл Цейс) и по методу Маллори. Исследование проводили с помощью микроскопа Axioskop 40.

Количественные данные обрабатывали методами параметрической статистики с использованием пакета программ «Microsoft Excel». Результаты считали достоверными при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Через 3 нед. воздействия CCl4 и этанола у животных I группы повысилась активность ферментов АЛТ, АСТ, ЩФ, ЛДГ соответственно на 94, 141, 83 и 134% по сравнению с интактным контролем (III группа) (табл. 1). Через 6 нед. эксперимента значительно возросли уровни ферментов АСТ, ЩФ по сравнению с 3-й неделей (соответственно на 27 и 89%), а с аналогичными показателями интактного контроля - до 200%. Активность ферментов АЛТ и ЛДГ через 6 нед. эксперимента оставалась на прежнем уровне. В течение восстановительного периода у животных I группы уровни АЛТ и ЛДГ оставались значительно повышенными по сравнению с аналогичными показателями интактного контроля (см. табл. 1). С помощью метода щелочной диссоциации у животных I группы выявлено уменьшение на 70% концентрации ядер гепатоцитов и их абсолютной численности. Двуядерные гепатоциты составили 0,87% от всей популяции клеток паренхимы (табл. 2), что свидетельствовало о низком уровне регенерации (в интактном контроле доля двуядерных гепатоцитов равнялась 14,5%) (см. табл. 2). Через 6 нед. концентрация ядер гепатоцитов, их абсолютное число и популяция двухдерных гепатоцитов оставались без существенной динамики. В течение восстановительного периода происходило увеличение концентрации ядер, абсолютного числа гепатоцитов и популяции двуядерных клеток (см. табл. 2), что, возможно, связано с включением естественных механизмов регенерации.

При светооптическом исследовании печени у животных I группы через 3 нед. эксперимента определялись следующие типы поражения гепатоцитов: диффузная мелко- и крупновезикулярная липидная инфильтрация, гидропическая дистрофия, являющиеся маркерами токсического и алкогольного воздействия [7]. Крупные капли липидов оттесняли на периферию ядра клеток, которые принимают перстневидную форму. В части гепатоцитов отмечалось слияние капель жира, что сопровождалось некрозом клеток и формированием внеклеточных жировых кист. Мелкоочаговые некрозы гепатоцитов локализовались в перипортальных и центролобулярных зонах, по их периферии регистрировалась лимфоцитарная инфильтрация; фиброз развивался по периферии печеночных балок. Синусоиды были заполнены фибрином и некротизированными гепатоцитами. Перипортально отмечалось большое количество сидерофагов. К 6-й неделе эксперимента у всех животных наблюдалось развитие портопортального и портоцентрального фиброза с пролиферацией желчных капилляров и прогрессированием к 8-й неделе в цирроз смешанного типа (крупно- и мелкоузловой). На основании этого можно сделать вывод о развитии у всех животных тяжелого токсического поражения печени с исходом в цирроз смешанного типа.

При введении животным АБК (II группа) выявлена положительная динамика изменений активности ферментов. Через 3 нед. эксперимента уровни АЛТ и АСТ были снижены на 42% по сравнению с I группой. Уровни ЩФ и ЛДГ были существенно ниже, чем в I группе, но превышали эти значения соответственно на 11 и 103% по сравнению с интактным контролем (см. табл. 1). Через 6 нед. отмечалось дальнейшее снижение уровней ферментов АСТ, АЛТ, ЩФ по сравнению с I группой, лишь значения ЛДГ оставались повышенными (см. табл. 1). У животных, получавших АБК, через 8 нед. наблюдалось восстановление до нормы уровня прямого билирубина, активности ЩФ, ЛДГ и АЛТ (см. табл. 1). Концентрация ядер гепатоцитов и их абсолютное число существенно увеличились лишь через 6 нед. (соответственно на 7 и 54%) (см. табл. 2). Доля двуядерных гепатоцитов через 3 и 6 нед. эксперимента достоверно не отличалась от таковой в I группе (см. табл. 2). Через 8 нед. отмечен рост популяции двуядерных гепатоцитов в данной группе до 7,1%, тогда как в I группе (воздействие CCl4 и этанола) этот показатель составил всего 1,8% (см. табл. 2). Увеличение концентрации ядер и абсолютного числа гепатоцитов на фоне применения АБК свидетельствовало о стимуляции регенераторной способности печени.

Таблица 1

Влияние аланинамида бетулоновой кислоты на биохимические показатели крови крыс на фоне токсического гепатита (M±m)

Экспериментальная группа

Срок эксперимента (нед)

Общий белок, г/л

Билирубин прямой, мкмоль/л

Глюкоза, моль/л

АЛТ, Ед/л

АСТ, Ед/л

ЩФ, Ед/л

ЛДГ, Ед/л

I группа - введение ССl4

3

87,5±12,2*

21,3±10,9

5,6±0,3

216,6±41,3**

400,4±151,3*

719,8±232,7*

1460,3±184**

6

97,02±5,9**

13,97±6,0

5,0 ±0,9*

202,35±41,0**

508,3±85,2**

1356,0±465,2**

1336,5±101,6**

8

98,32±8,1**

2,75±1,2**

6,9 ±0,3*

221,97±22,6**

296,9±29,9**

940,2±105,3**

1845,3±259,7**

II группа - введение аланинамида бетулоновой кислоты

3

82,0±8,4

11,6±2,4

6,0±0,3

128,3±11,7##

233,8±27,4

435,0±49,3#

1266,1±57,4

6

85,5±7,4#

20,7±1,5#

8,5±0,5##

78,9±5,5##

164,9±8,4##

317,6±26,7##

1414,0±68,4

8

103,6±7,9

5,8±1,8##

5,2±0,4##

107,7±15,4##

217,7±20,7##

285,5±32,2##

583,3±113,3##

III группа - интактный контроль

8

64,8±2,2

8,9±3,04

6,2±0,4

111,4±11,7

165,9±27,2

393,2±83,0

623,5±230,9

 

Примечание.

*; ** - p ≤ 0,05; p ≤ 0,01 - при сравнении с интактным контролем;

#; ## - p ≤ 0,05; p ≤ 0,01 - при сравнении с введением CCl4.

Таблица 2

Влияние аланинамида бетулоновой кислоты на популяционную динамику гепатоцитов при токсическом гепатите (M±m)

Экспериментальная группа

Срок эксперимента (нед)

Число ядер гепатоцитов в 1 мг ткани (∙103)

Абсолютное число ядер гепатоцитов (∙106)

Абсолютное число гепатоцитов (∙106)

Абсолютное число одноядерных гепатоцитов (∙106)

Абсолютное число двуядерных гепатоцитов (∙106)

I группа - введение ССl4

3

35,1±0,7**

398,4±32,1**

394,9±33,5**

391,5±34,8

3,4±1,5

6

64,7±3,6**

486,2±94,3**

466,1±89,8**

445,9±85,6

20,1±6,9

8

44,8±7,6**

595,1±116,9**

584,0±115,9**

573±115,0

11,0±3,7

II группа - введение аланинамида бетулоновой кислоты

3

43,04±3,4##

404,7±38,1

400,4±38,89

396,0±39,7

4,3±1,8

6

66,6±4,9

742,2±81,7##

719,1±77,4##

696,0±73,8

23,1±8,1

8

81,34±6,4##

745,2±54,5#

695,5±49,2

645,7±44,7

49,8±8,0

III группа -интактный контроль

8

115,7+4,70

1252,8+49,3

1093,9+45,7

935,0+42,7

158,9+6,00

Примечание.

*; ** - p ≤ 0,05; p ≤ 0,01 - при сравнении с интактным контролем;

#; ## - p ≤ 0,05; p ≤ 0,01 - при сравнении с введением CCl4.

При световой микроскопии у животных на фоне введения АБК отмечалась положительная динамика морфологических изменений печени на всех этапах эксперимента (3, 6, 8 нед.). В гепатоцитах выявлялась очаговая гидропическая, клеточно-инволютивная дистрофия и лишь у отдельных животных - очаговая мелковезикулярная липидная инфильтрация. На 3-й неделе эксперимента фиброзная ткань локализовалась преимущественно перипортально и в виде тонких портопортальных тяжей. В просвете синусоидов выявлялись скопления купферовских клеток. Через 6 и 8 нед. эксперимента признаки фиброза, цирроза и перестройки печеночных балок не выявлены.

Заключение

При длительном энтеральном применении АБК купирует признаки как холестаза, так и цитолиза, увеличивает регенераторный потенциал гепатоцитов, полностью предотвращает развитие фиброза и цирроза печени при токсическом воздействии CCl4 и этанола. Полученные результаты расширяют спектр фармакологической активности агента и позволяют рекомендовать АБК для дальнейшего исследования в качестве высокоактивного гепатопротектора.

Рецензенты:

  • Поляков Л.М., д.м.н., профессор, зав. лабораторией медицинской биотехнологии и зам. директора по научной работе Научно-исследовательского института биохимии Сибирского отделения РАМН, г. Новосибирск;
  • Любарский М.С., д.м.н., зав. отделом клинической морфологии и заместитель директора по научной работе Научно-исследовательского института клинической и экспериментальной лимфологии Сибирского отделения РАМН, г. Новосибирск.

Работа поступила в редакцию 30.03.2012.


Библиографическая ссылка

Толстикова Т.Г., Жукова Н.А., Семенов Д.Е., Бессергенева Е.П., Сорокина И.В., Баев Д.С., Глухов Б.М. БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ И КОЛИЧЕСТВО ГЕПАТОЦИТОВ В ПЕЧЕНИ КРЫС С ТОКСИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ ПРИ ДЕЙСТВИИ АЛАНИНАМИДА БЕТУЛОНОВОЙ КИСЛОТЫ // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 5-1. – С. 120-123;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=29858 (дата обращения: 25.11.2017).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252