Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,441

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК С ПОМОЩЬЮ МТТ И РЕСАЗУРИНА

Аникина Л.В. 1 Пухов С.А. 1 Дубровская Е.С. 1 Афанасьева С.В. 1 Клочков С.Г. 1
1 ФГБУН «Институт физиологически активных веществ» Российской академии наук
Проведено сравнительное исследование по определению жизнеспособности опухолевых клеток с помощью МТТ и ресазурина. Изучена антипролиферативная активность 10 модифицированных производных природного эпоксиалантолактона по отношению к опухолевым линиям клеток человека RD (рабдомиосаркома) и НСТ116 (карцинома кишечника). Показано, что цитотоксический эффект сесквитерпеновых лактонов имеет выраженный дозозависимый характер, индивидуальный для каждого соединения. Обнаружено, что значение ингибирующей концентрации, определенное с участием МТТ, ниже, чем в случае ресазурина, и зависит от клеточной культуры. На примере изученных соединений установлено, что для рутинных скрининговых исследований на адгезионных культурах клеток актуальным является МТТ-тест. Однако при мультиплексной задаче исследования и при использовании суспензионных культур более предпочтительным становится метод с участием ресазурина в качестве прижизненного красителя.
жизнеспособность клеток
МТТ
ресазурин
сесквитерпеновые лактоны
эпоксиалантолактон
аминопроизводные
антипролиферативная активность
1. Клочков С.Г., Афанасьева С.В., Булычев Ю.Н., Неганова М.Е., Шевцова Е.Ф. Синтез и биологическая активность конъюгатов изоалантолактона с триптаминами / Изв. акад. наук. Сер. хим. – 2012. – № 2. – С. 407– 412.
2. Клочков С.Г., Афанасьева С.В., Ерматова А.Б., Чудинов А.В. Модификация алантолактонов природными алкалоидами / Хим. прир. соед. – 2011. – № 5. – С. 630–637.
3. Пухов С.А., Неганова М.Е., Аникина Л.В., Шевцова Е.Ф., Афанасьева С.В., Клочков С.Г. Ингибирование роста клеток аденокарциномы молочной железы эпоксиалантолактоном и его производными / Фундаментальные исследования. – 2014. – № 9. – С. 1988–1992
4. Ahmed S.A., Gogal R.M., Walsh J.E. A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay // J. Immunol. Meth. – 1994. – Vol. 170, № 2. – P. 211–224.
5. Belinsky M., Jaiswal A.K. NAD(P)H: quinine oxidoreductase1DT-diaphorase expression in normal and tumor tissues // Cancer Metastasis Rev. – 1993. – Vol.12, № 2. – P. 103–117.
6. Boncler M., Różalski M., Krajewska U., Podsędek A., Watala C. Comparison of PrestoBlue and MTT assay of cellular viability in the assessment of anti-proliferative effects of plant extracts on human endothelial cells // J. Pharmacol. Toxicol. Meth. – 2014. – Vol. 69, № 1. – P. 9–16.
7. Cancer cell culture: methods and protocols / Ser. Methods in Molecular Medicine. Vol. 88. (Ed. S.P. Langdon) // Totowa, NJ: Humana Press, 2003. 165-169 p.
8. Chikuba K., Yubisui T., Shirabe K., Takeshita M. Cloning and nucleotide sequence of a cDNA of the human erythrocyte NADPH-flavin reductase // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1994. – Vol. 198, № 3. – P. 1170–1176.
9. Erb R.E., Ehlers M.N. Resazurin reducing time as an indicator of bovine semen fertilizing capacity // J. Dairy Sci. – 1950. – Vol. 33, № 12. – P. 853–864.
10. In vitro toxicity testing protocols / Ser. Methods in Molecular Biology. (Eds S.O’Hare, C.K. Atterwill). // Totowa. – NJ: Humana Press, 1995. – Vol. 43. – Р. 138–149.
11. Liu D. A rapid biochemical test for measuring chemical toxicity // Bull. Environ. Contam. Toxic. – 1981. – Vol. 26, № 1. – P. 145–149.
12. Mather J.P., Roberts P.E. Introduction to cell and tissue culture. Theory and technique. – New York: Plenum Press, 1998. – Р. 175–194.
13. Matsumoto K., Yamada Y., Takahashi M., Todoroki T., Mizoguchi K., Misaki H., Yuki H. A fluorometric flow-injec fluorometric determination of carnitine in serum with immobilized carnitine dehydrogenase and diaphorase // Clin. Chem. – 1990. – Vol. 36, № 12. – P. 2072–2076.
14. Miret S., De Groene E.M., Klaffke W. Comparison of in vivo assay of cellular toxicity in the human hepatic cell line HepG2 // J. Biomol. Screen. – 2006. – Vol. 11, № 2. – P. 184–193.
15. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay // J. Immunol. Meth. – 1983. – Vol. 65, № 1–2. – P. 55–63.
16. O’Brien J., Wilson I., Orton T., Pognan F. Investigation of Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity // Eur. J. Biochem. – 2000. – Vol. 267, № 17. – P. 5421–5426.
17. Rampersad S.N. Multiple applications of Alamar Blue as an indicator of metabolic function and cellular health in cell viability bioassays // Sensors. – 2012. – Vol. 12, № 9. – P. 12347–12360.

Под воздействием физиологически активных веществ клетки могут претерпевать изменения в морфологии, скорости клеточного роста, времени гибели и степени дезинтеграции, поэтому для каждого вещества, являющегося потенциальным фармакологическим агентом, необходимо выполнять оценку влияния на выживаемость клеток. Существуют различные методы определения цитотоксичности продуктов органического синтеза, природных соединений и экстрактов. Эти методы можно разделить на три группы:

1) измерение митохондриальной активности;

2) оценка выделения лактатдегидрогеназы или аденилаткиназы вследствие нарушения целостности цитоплазматической мембраны;

3) определение количества АТФ в клетках и активности киназы 3/7 как индикаторов клеточного некроза и апоптоза [14].

Первая группа методов особенно популярна в экспериментальных фармакологических исследованиях. Определение изменений в митохондриальной активности может быть определено с использованием МТТ (бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия) и ресазурина (натриевой соли 7-гидрокси-3Н-феноксазин-3-он-10-оксида) (рис. 1).

Метод МТТ, который был впервые описан Mosmann более 30 лет назад [15], широко используется как скрининговый метод измерения выживаемости клеток и включен в большинство протоколов методов молекулярной биологии и медицины [10; 7]. В его основе лежит реакция восстановления желтой соли тетразолия (МТТ) митохондриальными дегидрогеназами живых клеток до пурпурных кристаллов формазана, которые нерастворимы в водной среде обитания клеток. Кристаллы формазана (МТТ-ф) растворяют в ДМСО или в смеси HCl-изопропанол и определяют колориметрически. Эта процедура убивает живые клетки, то есть МТТ-тест является конечной точкой исследования. Кроме того, метод определения цитотоксичности с помощью МТТ плохо реализуется при использовании суспензионных культур, так как подразумевает полное удаление среды культивирования на стадии растворения кристаллов формазана. Однако преимуществами данного метода является экономичность и отличная воспроизводимость результатов.

pic_42.wmf pic_43.wmf

Рис. 1. Химические формулы использованных красителей

Ресазурин представляет собой водорастворимый прижизненный краситель, который используется с 1950-х годов для оценки бактериального и дрожжевого загрязнения биологических жидкостей и молока [9; 11]. Метод определения с его участием основан на способности живых клеток восстанавливать голубой нефлуоресцирующий ресазурин до розового флуоресцентного ресоруфина, который можно определить колориметрически или флуориметрически (последний способ более чувствителен) [4]. Ресазурин, в отличие от МТТ, восстанавливается более широким спектром ферментов: кроме митохондриальных дегидрогеназ его восстанавливают также цитохромы и дегидрогеназы, находящиеся в цитоплазме клетки [17]. Методологические особенности эксперимента с ресазурином позволяют использовать в исследовании суспензионные культуры и дают возможность в дальнейшем использовании культуры; то есть измерение выживаемости клеток при использовании ресазурина может быть первой, но не конечной, точкой эксперимента.

Целью данной работы является сравнение двух методов определения цитотоксичности – МТТ-теста и теста с участием ресазурина. Для решения задачи мы исследовали антипролиферативную активность 10 модифицированных производных природного эпоксиалантолактона по отношению к опухолевым линиям клеток человека RD (рабдомиосаркома) и НСТ116 (карцинома кишечника).

Материалы и методы исследования

В работе использовано оборудование Центра коллективного пользования научным оборудованием для создания генно-модифицированных линий животных и изучения эффективности соединений на оригинальных клеточных и трансгенных моделях нейродегенеративных заболеваний человека.

Исследуемые соединения

В качестве исследуемых соединений нами были выбраны аминопроизводные природного сесквитерпенового лактона – эпоксиалантолактона (1), который является минорным вторичным метаболитом растения Inula helenium L. Сведения о препаративной наработке исходного соединения и последующем модифицировании были опубликовано нами ранее [2; 1]. Мы также показали, что производные 2–11, сконструированные на основе эвдесманового сесквитерпенового лактона путем модифицирования рядом фармакофорных аминов, проявляют ингибирующую активность в отношении линии аденокарциномы молочной железы человека MCF7 [3]. Общая химическая структура исследуемых соединений приведена на рис. 2.

pic_44.wmf

Рис. 2. Общая формула исследуемых соединений

Культуры клеток

Культуры клеток человека RD (АТСС® CCL-136™) и НСТ116 (АТСС® CCL-247™) выращивали в среде DMEM (НПП ПанЭко) с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone®, Thermo Scientific), 2мM L-глутамина (НПП ПанЭко), 1 % гентамицина (ОАО Биохимик) в качестве антибиотика и инкубировали при 37 °C в атмосфере CO2 (5 %).

Общая методика

Клетки сеяли в 96-луночный планшет (CELLTREAT™) в количестве 1·104 клеток/200 мкл и культивировали при 37 °C в атмосфере CO2 (5 %). После 24 часов инкубации к культурам клеток были добавлены тестируемые соединения в различных концентрациях (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,12 и 1,56 мкМ), и далее клетки культивировали в тех же условиях 48 часов. Для каждой концентрации эксперименты были выполнены в трех повторностях. Все вещества растворяли в ДМСО (PANREAC QUÍMICA S.L.U), конечная концентрация ДМСО в лунке не превышала 1 % и не была токсична для клеток. В контрольные лунки добавляли растворитель в количестве 1 %.

Определение цитотоксичности МТТ-тестом

Цитотоксичность синтезированных соединений была определена с помощью МТТ-теста [12]. После инкубации с соединениями в каждую лунку было добавлено 20 мкл MTT (бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия) (5 мг/мл) (Sigma-Aldrich) и планшеты дополнительно инкубировали в течение 2 часов. Далее из планшетов удаляли среду и в каждую лунку добавляли по 100 мкл ДМСО для растворения образовавшихся кристаллов формазана. С помощью планшетного анализатора (Victor3, PerkinElmer) определяли оптическую плотность при 530 нм за вычетом измеренного фонового поглощения при 620 нм.

Определение цитотоксичности с помощью ресазурина

Цитотоксичность синтезированных соединений была определена по тесту Alamar Blue [16]. После инкубации с соединениями в каждую лунку было добавлено 22 мкл ресазурина (7-гидрокси-3Н-феноксазин-3-он-10-оксида натриевой соли) (Sigma-Aldrich) с конечной концентрацией 50 мкМ. Планшеты инкубировали в течение 2 часов. Флуоресценцию восстановленного красителя определяли с помощью планшетного ридера (Victor3, PerkinElmer) (возбуждение при 530 нм, эмиссия при 590 нм).

Значение концентрации, вызывающее 50 %-е ингибирование роста популяции клеток (IC50), было определено на основе дозозависимых кривых с помощью программного обеспечения OriginPro 9.0.

Результаты исследования и их обсуждение

Цитотоксический эффект сесквитерпеновых лактонов, определенный МТТ-тестом и с помощью ресазурина, по отношению к двум опухолевым линиям клеток человека имеет выраженный дозозависимый характер, индивидуальный для каждого соединения (рис. 3 и 4).

pic_45.tifpic_46.tif
Рис. 3. Восстановление МТТ до МТТ-ф клетками RD и HCT116 при воздействии исследуемыми соединениями. Значения абсорбции представлены в относительных единицах. Для контроля (без соединений, 1 % ДМСО) значения для линий RD и HCT116 составляют 0,94 ± 0,05 и 1,03 ± 0,08 соответственно. Для приведенных данных отображены значения ± SD (n = 3)
pic_47.tif
pic_48.tif

 

Рис. 4. Восстановление ресазурина до ресоруфина клетками RD и HCT116 при воздействии исследуемыми соединениями. Значения флуоресценции представлены в относительных единицах. Для контроля (без соединений, 1 % ДМСО) значения для линий RD и HCT116 составляют 6∙105 ± 1∙104 и 9∙105 ± 2∙104 соответственно. Для приведенных данных отображены значения ± SD (n = 3)

Проведенные исследования позволили определить эффективные концентрации соединений, вызывающие 50 % ингибирование выживаемости клеток (IC50). Значения IC50 всех тестируемых соединений приведены в таблице.

Значения IC50 (мкМ) модифицированных производных эпоксиалантолактона

Соединение

МТТ-тест

Тест с помощью ресазурина

RD

HCT116

RD

HCT116

L05-0003 (2)

12,79 ± 0,78

16,14 ± 1,82

46,69 ± 1,11

59,69 ± 0,30

L05-0619 (3)

17,07 ± 1,00

10,97 ± 0,41

43,19 ± 2,51

82,52 ± 2,10

L05-5272n (4)

24,94 ± 0,50

36,07 ± 0,82

33,38 ± 0,40

47,86 ± 1,50

L05-6640 (5)

11,94 ± 0,33

10,04 ± 1,64

44,94 ± 1,04

42,61 ± 1,87

L05-0218 (6)

18,10 ± 0,90

17,62 ± 0,06

36,12 ± 0,45

46,40 ± 1,78

L05-5702 (7)

18,04 ± 0,09

23,91 ± 6,17

70,29 ± 1,89

85,83 ± 6,96

L05-6605 (8)

4,21 ± 0,01

6,04 ± 0,09

21,36 ± 0,26

23,79 ± 0,32

L05-0140 (9)

5,38 ± 0,01

20,36 ± 0,42

37,65 ± 0,25

46,76 ± 0,58

L05-6747 (10)

2,86 ± 0,06

11,09 ± 1,83

35,85 ± 0,04

23,49 ± 1,34

L05-5418 (11)

5,54 ± 0,13

12,20 ± 0,05

51,10 ± 0,62

60,29 ± 0,86

Из таблицы видно, что в целом значение ингибирующей концентрации IC50, полученное в результате использования МТТ, является более низким, чем полученное с помощью ресазурина. Разница между IC50 также варьируется в зависимости от клеточной культуры. В случае с культурой НСТ116 она менее выражена и составляет от 1,3 раза (для соединения L05-5272n) до 7,5 раз (для соединения L05-0619). В случае с культурой RD она составляет от 1,3 раза (для соединения L05-5272n) до 12,5 раз (для соединения L05-6747).

Можно предположить, что полученная разница в значениях IC50 при использовании двух красителей является закономерной. Как было указано выше, ресазурин восстанавливается более широким спектром ферментов, чем МТТ. Кроме митохондриальных дегидрогеназ ресазурин восстанавливают также цитохромы и дегидрогеназы, находящиеся в цитоплазме клетки, а именно диафоразы [13; 5] и флавинредуктазы [8]. В то время как митохондриальная активность клеток угасает из-за проявления цитотоксичности соединений, цитоплазматические ферментные системы еще остаются в рабочем состоянии и определяются по восстановлению ресазурина. Более низкие значения IC50, получаемые с помощью красителя МТТ, предпочтительнее при переходе на исследование специфической противоопухолевой активности и острой токсичности в моделях in vivo. Кроме того, из литературных данных следует, что МТТ-тест показывает бóльшую воспроизводимость результатов, оцениваемую по коэффициенту вариации и отношению сигнал/фон [6].

Таким образом, на примере 10 физиологически активных производных эпоксиалантолактона нами было проведено сравнительное определение цитотоксичности с использованием двух красителей. Было установлено, что для рутинных скрининговых исследований на адгезионных культурах клеток актуальным остается МТТ-тест. Однако при мультиплексной задаче исследования и при использовании суспензионных культур более предпочтительным становится метод с участием ресазурина в качестве прижизненного красителя.

Рецензенты:

Григорьев В.В., д.б.н., заведующий лабораторией нейрорецепции, ФГБУН «Институт физиологически активных веществ» Российской академии наук, г. Черноголовка;

Серков И.В., д.х.н., ведущий научный сотрудник лаборатории специального органического синтеза, ФГБУН «Институт физиологически активных веществ» Российской академии наук, г. Черноголовка.

Работа поступила в редакцию 27.12.2014.


Библиографическая ссылка

Аникина Л.В., Пухов С.А., Дубровская Е.С., Афанасьева С.В., Клочков С.Г. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК С ПОМОЩЬЮ МТТ И РЕСАЗУРИНА // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 12-7. – С. 1423-1427;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=36378 (дата обращения: 23.06.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074