Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,087

ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS НА ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ SINAPIS ALBA ПРИ Cd-СТРЕССЕ

Курамшина З.М. 1 Смирнова Ю.В. 1 Хайруллин Р.М. 2
1 Стерлитамакский филиал Башкирского государственного университета
2 Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН
Изучено влияние предварительной инокуляции семян клетками эндофитных штаммов бактерий Bacillus subtilis 26Д и 11ВМ на рост горчицы белой (Sinapis alba) и образование малонового диальдегида (МДА) в тканях растений в условиях воздействия ионов кадмия (Cd-стресс). Показано, что растения, инокулированные клетками B. subtilis, при Cd-стрессе отличались более высокими показателями биомассы и менее интенсивным накоплением продуктов перекисного окисления липидов, чем необработанные бактериями растения. Пониженное содержание малонового диальдегида в тканях растений, инокулированых клетками бактерий, может свидетельствовать о менее интенсивном развитии окислительного стресса, вызванного ионами Cd. Ростстимулирующий и антистрессовый эффекты Bacillus subtilis были более заметны при выращивании растений в почве в вегетационных опытах, чем при росте растений в чашках Петри в водном растворе.
Sinapis alba
Bacillus subtilis
перекисное окисление липидов
Cd-стресс
1. Архипова Т.Н., Веселов С.Ю., Мелентьев А.И., Мартыненко Е.В., Кудоярова Г.Р. Сравнение действия штаммов бактерий, различающихся по способности синтезировать цитокинины, на рост и содержание цитокининов в растениях пшеницы // Физиология растений. – 2006. – Т. 53, № 4. – С. 567–574.
2. Егоршина А.А., Хайруллин Р.М., Лукьянцев М.А., Курамшина З.М., Смирнова Ю.В. Фосфат-мобилизующая активность эндофитных штаммов Bacillus subtilis и их влияние на степень микоризации корней пшеницы // Журнал Сибирского федерального университета. Серия: Биология. – 2011. – Т. 4, № 2. – С. 172–182.
3. Курамшина З.М., Смирнова Ю.В., Хайруллин Р.М. Повышение толерантности проростков подсолнечника Helianthus annuus, инокулированных эндофитным штаммом Bacillus subtilis, к действию тяжелых металлов. Сообщение 2. Антистрессовая активность эндофита Bacillus subtilis 26D при действии тяжелых металлов на растения подсолнечника Helianthus annuus // IV Всероссийская научно-практическая конференция «Проблемы экологии Южного Урала»: приложение к 10 номеру (2009 г.) журнала «Вестник ОГУ», 20–21 октября 2009 г. – Оренбург: Оренбургский государственный университет, 2009. – С. 461–463.
4. Мелентьев А.И. Аэробные спорообразующие бактерии Bacillus Cohc в агроэкосистемах. – М.: Наука, 2007. – 147 с.
5. Cho U.H., Seo N.H. Oxidative Stress in Arabidopsis thaliana Exposed to Cadmium Is due to Hydrogen Peroxide Accumulation // Plant Science – 2005. – Vol. 168. – P. 113–120.
6. Costa H., Gallego S.M., Tomaro M.L. Effect of UV-B radiation on antioxidant defense system in sunflower cotyledons // Plant Science – 2002. – Vol. 162. – P. 939–945.
7. Montiller J.L., Cacas J.-L., Montane M.-H. The upstream oxylipin profile of Arabidopsis thaliana: A tool to scan for oxidative stresses // Plant Journal – 2004. – Vol. 40. – P. 439–450.
8. Toppi L.S., Gabbrielli R. Response to Cadmium in Higher Plants // Environ. Exp. Bot. – 1999. – Vol. 41. – P. 105–130.

В последние десятилетия в промышленно развитых странах увеличивается степень загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами. Кадмий, относящийся к числу токсичных элементов, попадает в экосистемы, главным образом, в результате производства химических продуктов и использования фосфатных удобрений. Его концентрации в почвах угодий могут достигать высоких значений, а сам металл в виде ионов легко ассимилируется растениями [8]. Токсичность кадмия в растительном организме связана с увеличением перекисного окисления липидов (ПОЛ) и изменением антиоксидантной системы растений [5]. Следствием таких процессов могут быть нарушения метаболизма и гибель растений.

В настоящее время все большее значение для повышения устойчивости растений к стрессовым факторам приобретают исследования в области биотехнологий, использующих микроорганизмы. Ранее нами было показано протекторное действие клеток эндофитного штамма Bacillus subtilis 26Д на рост подсолнечника Helianthus annuus при действии ионов кадмия [3]. В связи с этим интересен вопрос о специфичности такого эффекта и механизмах его проявления, а также роли эндофитных бактерий в развитии окислительного стресса растений, вызванного тяжелыми металлами. Цель настоящей работы заключалась в изучении влияния обработки семян Sinapis alba клетками B. subtilis штаммов 26Д и 11ВМ на рост растений и образование малонового диальдегида (МДА) при стрессе, вызванном ионами кадмия.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служили растения горчицы белой (Sinapis alba L.). Семена перед посевом промывали мыльным раствором, затем выдерживали 1 мин в 96 %-м этаноле, ополаскивали в стерильной дистиллированной воде. В опытах использовали 20-часовую культуру бактерий, растущую на мясо-пептонном агаре при + 37 °С. Клетки бактерий отмывали 0,001 М KCl. Суспензию клеток доводили до необходимой концентрации по оптической плотности. 1 г семян обрабатывали в ламинар-боксе 20 мкл суспензии клеток бактерий с титром 1 млрд/мл.

Исследования проводили в чашках Петри и вегетационных сосудах в почве. Инокулированные и контрольные семена выращивали в чашках Петри (d = 140 мм, h = 24 мм) на фильтровальной бумаге, смоченной дистиллированной водой или раствором Cd(NO3)2•4H2O. Раствор соли готовили в пересчете на содержание иона металла. В вегетационных опытах использовали чернозем выщелоченный. В варианте с имитацией Cd-стресса после посева семян почву поливали раствором соли, а в контроле – дистиллированной водой. Растения выращивали при температуре 18–20 °С. Размещение вегетационных сосудов меняли каждый день по единой схеме, чтобы обеспечить более равномерную освещенность. В чашках Петри измерение сырой массы и концентрацию МДА проводили на 3, 4, 5 сутки от начала эксперимента; в вегетационных опытах – на 3, 6, 9, 14, 30 сутки.

Содержание МДА измеряли, используя метод Costa с соавторами [6], основанный на образовании окрашенного комплекса между МДА и тиобарбитуровой кислотой (ТБК) при нагревании. Концентрацию МДА определяли при 532 нм с помощью спектрофотометра UNICO 2800, вычитая величину неспецифической экстинкции при 600 нм. Содержание МДА рассчитывали с использованием коэффициента экстинкции, равного 155 мМ–1см–1. Все эксперименты проводили в трех биологических повторностях. В таблицах приведены средние арифметические значения и их стандартные ошибки.

Результаты исследования и их обсуждение

Интегральным показателем, характеризующим рост растений и его органов в условиях стресса, является биомасса. Сырая масса как побегов, так и корней растений, предобработанных клетками B. subtilis, была больше контрольных, что было особенно заметно на пятые сутки выращивания в чашках Петри (рисунок) и на тридцатые – в вегетационных опытах в почве (табл. 1). Так, обработка семян горчицы клетками обоих штаммов B. subtilis повышала массу корней в чашках Петри в среднем на 15 %, побегов – на 9 %. В вегетационных опытах масса побегов растений повышалась при инокуляции семян бациллами на 11 %.

pic_56.wmf а  pic_57.wmf б

Влияние инокуляции семян бактериями B. subtilis на рост S. alba в присутствии ионов кадмия в чашках Петри: а – масса побегов; б – масса корней. Варианты опыта: I – контроль; II – растения, обработанные B. subtilis 26Д; III – растения, обработанные B. subtilis 11 ВМ; IV – Cd 20 мг/л; V – растения, обработанные B. subtilis 26Д + Cd 20 мг/л; VI – растения, обработанные B. subtilis11 ВМ + Cd 20 мг/л.

Таблица 1

Сырая масса побегов горчицы, выращенных в почве, загрязненной кадмием (100 растений, г)

Вариант

Сутки

3

6

9

14

30

Cd 0 мг/кг

Контроль

3,1 ± 0,5

6,0 ± 0,6

7,2 ± 0,6

8,7 ± 0,7

11,0 ± 0,3

B. subtilis 26Д

3,2 ± 0,5

6,0 ± 0,5

7,2 ± 0,3

8,8 ± 0,8

12,4 ± 0,2

B. subtilis 11ВМ

2,9 ± 0,3

5,9 ± 0,2

6,9 ± 0,3

8,8 ± 0,8

12,1 ± 0,2

Cd 10 мг/кг

Контроль

3,8 ± 0,9

5,4 ± 0,6

7,7 ± 0,6

8,1 ± 1,1

10,6 ± 1,1

B. subtilis 26Д

2,8 ± 0,5

5,7 ± 0,4

8,2 ± 1,0

8,5 ± 1,1

12,4 ± 0,8

B. subtilis 11ВМ

3,4 ± 0,6

5,9 ± 0,6

8,2 ± 0,3

9,4 ± 0,9

10,8 ± 0,7

Cd 200 мг/кг

Контроль

3,7 ± 0,6

6,3 ± 1,1

7,9 ± 0,9

9,2 ± 1,1

10,1 ± 0,8

B. subtilis 26 Д

2,7 ± 0,3

6,0 ± 0,3

8,4 ± 0,3

9,3 ± 1,0

12,1 ± 0,5

B. subtilis 11ВМ

3,6 ± 0,7

6,4 ± 0,7

9,3 ± 1,1

10,5 ± 0,9

11,9 ± 1,0

Ростстимулирующий эффект бактерий, вероятно, связан с тем, что бациллы могут продуцировать фитогормоно подобные вещества [1, 4], а также повышать содержание питательных веществ в доступной для растений форме [2] и подавлять развитие фитопатогенных микроорганизмов [4].

При выращивании горчицы в чашках Петри присутствие ионов кадмия в концентрации 20 мг/л вызывало снижение массы корней на пятые стуки на 34 %, а побегов – на 13 %. Два изученных штамма бацилл по-разному действовали на рост растений в присутствии ионов кадмия. Обработка семян штаммом B. subtilis 26Д не повышала устойчивость проростков к токсичным ионам металла – масса корней при Cd-стрессе также снижалась почти на 30 % в сравнении с инокулированными растениями, растущими на контрольной среде без кадмия. В отличие от штамма B. subtilis 26Д клетки штамма 11ВМ проявляли четкий протекторный эффект. Масса растений, предобработанных клетками бактерий B. subtilis 11ВМ, при Cd-стрессе не отличалась от таковой у контрольных растений, растущих на воде, что свидетельствует о защитном действии клеток этого штамма при действии токсичных ионов металла. Масса побегов растений, предобработанных клетками обоих штаммов бактерий, снижалась при действии кадмия так же, как и в контроле, в среднем на 13 %.

В вегетационных опытах при действии ионов кадмия в изученных концентрациях достоверно значимого протекторного эффекта выявить не удалось и можно говорить лишь о тенденции его проявления при обработке семян клетками бацилл.

Известно, что токсическое действие кадмия на растения проявляется в развитии окислительного стресса и образовании активных форм кислорода (АФК). АФК способны инициировать перекисное окисление липидов, в результате чего происходит повреждение мембранных структур. Кроме того, продукты ПОЛ (4-гидроксиалкенали, малоновый диальдегид и др.) обладают мутагенной активностью и блокируют клеточное деление [7].

Считается, что такой продукт ПОЛ, как малоновый диальдегид (МДА), может быть использован как биологический индикатор развития окислительного стресса растений при токсичном действии кадмия и других металлов [7].

При выращивании горчицы в чашках Петри достоверного влияния бацилл, а также ионов кадмия на содержание МДА в корнях растений выявить не удалось (табл. 2). При анализе этого показателя в побегах трехсуточных растений, предобработанных клетками бактерий, растущих на воде, отмечалась тенденция увеличения содержания МДА в сравнении с контролем. Затем эти различия сглаживались.

Таблица 2

Содержание МДА в растениях горчицы белой при воздействии ионов кадмия в водном растворе, 10–5 мМ/г сырого веса

Варианты

Сутки

3

4

5

Корни

Cd 0 мг/л

Контроль

6,6 ± 1,3

6,7 ± 1,1

6,6 ± 0,4

B. subtilis 26Д

6,4 ± 0,6

6,8 ± 0,6

6,2 ± 0,1

B. subtilis 11ВМ

5,9 ± 0,8

6,1 ± 0,5

6,1 ± 0,4

Cd 20 мг/л

Контроль

5,8 ± 0,7

6,4 ± 1,5

6,1 ± 0,2

B. subtilis 26Д

6,1 ± 0,9

7,2 ± 1,2

5,6 ± 0,4

B. subtilis 11ВМ

5,8 ± 0,7

6,0 ± 0,6

5,8 ± 0,5

Побеги

Cd 0 мг/л

Контроль

10,7 ± 2,3

13,0 ± 1,9

12,09 ± 0,6

B. subtilis 26Д

12,0 ± 2,7

11,0 ± 1,9

13,6 ± 0,9

B. subtilis 11ВМ

14,8 ± 4,4

12,5 ± 2,3

11,5 ± 0,6

Cd 20 мг/л

Контроль

8,3 ± 1,0

9,8 ± 1,6

11,3 ± 0,6

B. subtilis 26Д

10,6 ± 2,0

8,8 ± 1,5

9,9 ± 0,1

B. subtilis 11ВМ

9,1 ± 1,6

11,2 ± 2,0

10,3 ± 0,4

При Cd-стрессе в побегах пятисуточных контрольных и предобработанных бактериями, растущих на воде, содержание МДА было выше, чем у растущих в присутствии ионов металла. При этом инокуляция проростков бациллами приводила к снижению уровня МДА в побегах при действии ионов кадмия.

В вегетационных опытах выявлено в среднем двукратное снижение уровня МДА в побегах контрольных растений при содержании ионов металла в концентрации 20 мг/кг и 200 мг/кг почвы. Вероятно, это связано с тем, что гумус черноземных почв способен адсорбировать ионы кадмия в таких концентрациях и, таким образом, не только снижать пресс Cd-стресса, но благоприятствовать реакциям растительных клеток, связанным со снижением ПОЛ.

Если в чашках Петри при инокуляции семян клетками бацилл мы смогли выявить лишь тенденцию повышения уровня МДА в сравнении с контрольными растениями, то в вегетационном опыте у трехсуточных растений наблюдали повышенный в 1,8 раза уровень МДА в сравнении с контрольными растениями (табл. 3). Это может быть связано с активным внедрением эндофитов в ткани растений горчицы в этом возрасте и ответной реакцией растительных клеток на этот процесс. Впоследствии в тканях побегов четырнадцати- и тридцатидневных растений, инокулированных бактериями, содержание МДА было ниже, чем у контрольных.

Таблица 3

Содержание МДА в побегах горчицы белой при воздействии ионов кадмия в почве (10–5 мМ/г сырого веса)

Вариант

Сутки

3

6

9

14

30

Cd 0 мг/кг

Контроль

6,4 ± 0,6

1,9 ± 0,3

2,9 ± 0,2

3,3 ± 0,2

3,5 ± 0,4

B. subtilis 26Д

6,0 ± 0,6

1,3 ± 0,3

3,0 ± 0,1

2,1 ± 0,2

2,0 ± 0,2

B. subtilis 11ВМ

5,9 ± 0,2

3,5 ± 0,1

2,5 ± 0,1

2,5 ± 0,1

2,2 ± 0,1

Cd 10 мг/кг

Контроль

3,1 ± 0,3

3,0 ± 0,1

3,2 ± 0,5

3,6 ± 0,2

4,3 ± 0,6

B. subtilis 26Д

4,8 ± 0,9

2,8 ± 0,1

2,4 ± 0,2

2,9 ± 0,2

2,8 ± 0,1

B. subtilis 11ВМ

5,6 ± 0,8

2,0 ± 0,1

1,4 ± 0,4

3,6 ± 0,7

3,1 ± 0,3

Cd 200 мг/кг

Контроль

3,0 ± 0,4

2,5 ± 0,4

2,4 ± 0,5

3,5 ± 0,6

5,5 ± 0,7

B. subtilis 26Д

4,4 ± 0,2

1,1 ± 0,2

1,7 ± 0,2

2,3 ± 0,6

3,6 ± 0,2

B. subtilis 11ВМ

5,3 ± 0,5

1,7 ± 0,1

1,5 ± 0,2

2,5 ± 0,4

3,7 ± 0,2

Аналогичная закономерность проявилась еще раньше – у девятисуточных растений при Cd-стрессе. В тканях побегов инокулированных бактериями растений пониженный в сравнении с контрольными уровень МДА при действии ионов кадмия сохранялся вплоть до тридцати суток (табл. 3).

Заключение

Таким образом, кроме известных ростстимулирующего эффекта эндофитных штаммов бактерий Bacillus subtilis по отношению к растениям, а также фунгицидного по отношению к фитопатогенным грибам [1, 4] нами выявлен протекторный эффект эндофитных бактерий при действии токсичных ионов кадмия. Анализ уровня МДА в тканях растений, указывающий на активность ПОЛ, выявил, что его содержание в тканях побегов растений горчицы, предобработанных клетками энофитов и растущих в почве в условиях Cd-стресса, ниже, чем в контрольных. Этот факт раскрывает один из механизмов защитного действия эндофитных штаммов бактерий на растения, который может быть связан со снижением интенсивности развития окислительного стресса и сохранением целостности мембранного аппарата растительных клеток, что важно для проявления их барьерной функции по отношению к ионам токсичного металла.

Рецензенты:

Карпов Д.Н., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биологии естественнонаучного факультета Стерлитамакского филиала Башкирского государственного университета, г. Стерлитамак;

Зейферт Д.В., д.б.н., доцент кафедры биологии естественнонаучного факультета Стерлитамакского филиала Башкирского государственного университета, г. Стерлитамак.

Работа поступила в редакцию 15.09.2014.


Библиографическая ссылка

Курамшина З.М., Смирнова Ю.В., Хайруллин Р.М. ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS НА ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ SINAPIS ALBA ПРИ Cd-СТРЕССЕ // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 9-11. – С. 2460-2464;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=35380 (дата обращения: 15.08.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074