Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Глушков А.Н. 1 Красильникова К.С. 1 Поленок Е.Г. 1 Гордеева Л.А. 1 Костянко М.В. 2

---

1 ФГБУН Институт экологии человека Сибирского отделения РАН

2 ФГБОУ ВПО «Кемеровский государственный университет»

Исследовали специфические иммунные реакции на химические канцерогены окружающей среды и стероидные гормоны у беременных женщин в норме и при наличии пороков развития у плода. Обнаружено, что у беременных женщин в норме образование антител к стероидным гормонам и химическим канцерогенам – взаимосвязанные процессы. При врождённых пороках развития плода взаимосвязи уровней антител к бензо[а]пирену, эстрадиолу и прогестерону имеют характерные особенности: при повышении уровня IgA к бензо[а]пирену уровни IgG к бензо[а]пирену возрастают больше, а уровни IgG к прогестерону и эстрадиолу меньше, чем в норме. Эти различия особенно выраженны при определённых полиморфных вариантах генов ферментов биотрансформации. При повышении уровня IgA к бензо[а]пирену у женщин с ВПРП имеет место наибольший рост IgG к бензо[а]пирену у гомозигот А/А и наименьший рост IgG к эстрадиолу и прогестерону при наличии аллеля С гена CYP1A2*1F. Полученные результаты подтверждают ранее высказанное предположение о дисбалансе иммунных реакций на низкомолекулярные ксено- и эндобиотики при тератогенезе.

Статья в формате PDF

387 KB

антитела

бензо[а]пирен

эстрадиол

прогестерон

врождённые пороки развития плода

генетический полиморфизм

CYP

GST.

1. Глушков А.Н. Антитела к бензо[а]пирену, эстрадиолу и прогестерону и генетический полиморфизм CYP1A2*1F, GSTT1и GSTM1 у беременных женщин с врождёнными пороками развития плода / А.Н. Глушков, К.С. Красильникова, Е.Г. Поленок, Т.П. Аносова, М.П. Аносов, Л.А. Гордеева, О.С. Попова, И.В. Шаталина, А.Е. Шутров, М.В. Костянко // Российский иммунологический журнал. – 2012. – № 6(15), Т.2. – С.162-169.

2. Глушков А.Н. Сывороточные антитела к бензо[а]пирену и хромосомные аберрации в лимфоцитах периферической крови у рабочих углеперерабатывающего предприятия / А.Н. Глушков, Е.Г. Поленок, Т.П. Аносова, Я.А. Савченко, М.Л. Баканова, В.И. Минина, С.А. Мун, С.А. Ларин, М.В. Костянко // Российский иммунологический журнал. – 2011. – №5(14), Т.1. – С.39-44.

3. Гордеева Л.А. Сочетание материнских полиморфизмов CYP1A2*1F и GST при врождённых пороках развития у плода и новорожденных / Л.А. Гордеева, О.А. Глушкова, Н.А. Ермоленко, О.С. Попова, Ю.В. Гареева, А.В. Шаталин, Е.Н. Воронина, В.И. Минина, А.В. Остапцева, Т.А. Симонова, И.М. Сутулина, М.Л. Филипенко, А.Н. Глушков // Медицинская генетика. – 2011. – №11. – С.9-15.

4. Менжинская И.В. Антипрогестероновые антитела в клинике первичной потери беременности / И.В. Менжинская, К.А. Гладкова, В.М. Сидельникова, Г.Т. Сухих // Иммунология. – 2008. – №1. – С.34–37.

5. Поленок Е.Г. Антитела к ксено- и эндобиотикам у женщин с привычным невынашиванием беременности / Е.Г. Поленок, Т.П. Аносова, М.П. Аносов, М.В. Костянко, А.Н. Глушков // Известия Самарского научного центра РАН. – 2009. – Т. 11. – №5(2). – С. 475-477.

6. Bourtourault M. Effects of simultaneous active immunization against 17 beta-estradiol and testosterone on pituitary and ovarian activity in rat / M. Bourtourault, V. Shacoori, J. Guerin, B. Saiag, B. Rault // Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. – 1991. – №72(3). – Р.273-284.

7. Cernohorska Н. Influence of immunization with non-genotoxic PAH-KLH conjugates on the resistance of organisms exposed to benzo[a]pyrene / Н. Cernohorska, S. Klimesova, L. Lepsa, P. Jinoch, A. Milcova, J. Schmuczerova, J. Topinca, J. Labaj // Mut. Res. – 2012. – №742. – Р.2-10.

8. Ching-Fong Chang. Increase luteinizing hormone secretion and ovarian function in heifers actively immunized against estrogen and progesterone / Ching-Fong Chang, A.J. Roberts, J.J. Reeves // J. Anim. Sci. – 1987. – № 65. – Р. 771-776.

9. De Buck S.S. Specific antibody modulates absorptive transport and metabolic activation of benzo[a]pyrene across Caco-2 monolayers / S.S. De Buck, P. Augustijns, C.P. Muller // J. Pharmacol. Experim. Therap. – 2005. – №313(2). – Р.640-646.

10. Hatch N.C. Polycyclic aromatic hydrocarbon-DNA adducts in spontaneously aborted fetal tissue / N.C. Hatch, D. Warburton, R.M. Santella // Carcinogenesis. – 1990. – №11(9). – Р.1673-1675.

11. Hayes J.D. Glutathione transferases / J.D. Hayes, J.U. Flanagan, I.R. Jowsey // Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. – 2005. – №45. – Р.51-88.

12. Kelvin E.A. Modulation of the effect of prenatal РАНexposure on-DNA adducts in cord blood plasma antioxidants / E.A. Kelvin, S. Edwards, W. Jedrychowski, R.L. Schleicher, D. Camann, D. Tang, F.P. Perera // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. – 2009. – Р.2262-2268.

13. Manchester D.K. Synchronic fluorescence spectroscopic, immunoaffinity chromatographic and 32P-postlabeling analysis of human placental DNA known to contain benzo[a]pyrenediol epoxide adducts / D.K. Manchester, V.L. Wilson, I.-C. Hsu, J.-S. Choi // Carcinogenesis. – 1990. – №11. – Vol.4. – P.553–559.

14. Perera F.P. DNA damage from polycyclic aromatic hydrocarbons measured by benzo[a]pyrene-DNA adducts in mothers and newborns from Northern Manhattan, the World trade Center Area, Poland, and China / F.P. Perera, D. Tang, R.M. Whyatt, S.A. Lederman, W. Jedrychowski // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. – 2005. – №14. – Р.709-714.

15. Whyatt R.M. Association between Polycyclic Aromatic Hydrocarbon-DNA Adduct Levels in Maternal and Newborn White Blood Cells and Glutathione S-transferase P1 and CYP1A1 Polymorphisms / R.M. Whyatt, F.P. Perera, W. Jedrychowski, R.M. Santella // Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. – 2000. – №9. – Р.207–212.

Химические канцерогены окружающей среды и эндогенные стероиды, будучи низкомолекулярными органическими соединениями, не способны индуцировать синтез специфических антител (АТ). Однако под действием ферментов биотрансформацииI фазы (CYP) они превращаются в реактивные метаболиты, которые образуют аддукты с макромолекулами – ДНК и белками. Инактивацию и выведение из организма реактивных метаболитов обеспечивают ферменты II фазы биотрансформации, в том числе GST.

Аддукты низкомолекулярных ксено- и эндобиотиков, в частности бензо[а]пирена (БП) и эстрагенов, обнаружены в различных тканях человека, в частности, в плаценте [13], а также в сыворотке крови беременных женщин, плодов и новорожденных детей [10, 12, 14]. Выявлены ассоциации генетических полиморфизмов CYP и GST с количеством аддуктов, в том числе в сыворотке крови беременных женщин и плодов [15]. В ответ на образование аддуктов иммунная система реагирует синтезом гаптен-специфических АТ. АТ к БП, эстрадиолу (ЭС) и прогестерону (ПГ) обнаружены в сыворотках крови беременных женщин, в том числе при врождённых пороках развития плода (ВПРП) и при привычном невынашивании беременности [1, 4, 5].

В многочисленных экспериментах in vitro и in vivo показано, что АТ к химическим канцерогенам способны модулировать их проникновение из окружающей среды через поверхностный эпителий в кровь и распределение по разным органам [7, 9]. В свою очередь индукция АТ к стероидным гормонам приводит к повышению их содержания в сыворотке крови, нарушению эндокринной регуляции беременности и её прерыванию [6, 8].

Поэтому весьма вероятно, что АТ к химическим канцерогенам и стероидным гормонам, обнаруженные у женщин в естественных условиях, принимают участие в процессе тератогенеза и вынашивании беременности.

Цель настоящего исследования – выявить особенности взаимосвязи образования АТ к стероидным гормонам (АТ-ЭС и АТ-ПГ) с АТ к химическим канцерогенам (АТ-БП) у беременных женщин, в том числе при ВПРП.

Материалы и методы

Описание исследуемых групп.

Исследовали сыворотки венозной крови 282 беременных женщин, находящихся во II триместре беременности (13-27 недель гестации). По результатам УЗИ, у 101 женщины выявлены ВПРП, превалировали пороки сердечно-сосудистой (23,4 %), моче-выделительной (20,6 %), центральной нервной (18,3 %), костно-мышечной систем (15,8 %), а также множественные ВПРП (12 %). Средний возраст в группе составил 26,4±4,8 лет. 186 беременных женщин, являющихся условно здоровыми, были отнесены в группу сравнения. Средний возраст – 27,5±5,2 лет.

Исследования антител.

АТ к БП, ЭС и ПГ определяли методом неконкурентного ИФА в собственной модификации с использованием коньюгатов БП, ЭС и ПГ с бычьим сывороточным альбумином (БСА) [2]. В лунки полистирольных иммунологических планшетов вносили по 100 мкл коньюгата гаптен-БСА в концентрации 2 мкг/мл и инкубировали при температуре 250С в течении ночи. Для оценки фонового связывания с белком в отдельные лунки вносили неконьюгированный БСА. Для определения АТ к БП, ЭС и ПГ сыворотку крови разводили 1:20 (для IgA-АТ) и 1:100 (для IgG-АТ) блокирующим раствором. Связавшиеся АТ выявляли с помощью кроличьих АТ против IgG человека, меченых пероксидазой хрена («Sigma», Германия). Регистрацию адсорбированных на планшете АТ проводили с помощью субстратного буфера, содержащего 3,3ʼ,5,5ʼ-тетраметилбензидин (ТМБ, США), на фотометре (Пикон, Россия) при длине волны 450 нм.

Уровень AT, специфичных к БП и стероидным гормонам, определяли по формулам:

АТ-X = (OD(X-БСА) – OD(БСА)) / OD(БСА),

где OD – значение оптической плотности в соответствующих лунках, X – БП, ЭС или ПГ соответственно.

Исследование полиморфных вариантов генов детоксикации.

Используемые тест-системы для молекулярно-генетического анализа SNP- полиморфизма гена CYP1A2 (-163 A ->C) и полиморфизмов GSTM1(del) и GSTT1(del) были разработаны в ИХБФМ СО РАН (г. Новосибирск).

Исследование полиморфного варианта CYP1A2*1F проводили с помощью ПЦР/ПДРФ анализа, а GSTM1(del) и GSTT1(del) – методом мультиплексной RealTime ПЦР, как описано ранее [3]. Гетерозиготы по мутации (генотип «+/0») рассматривались в одной группе с носителями нормальных генов («+»). Отсутствие функциональной активности ферментов II фазы детоксикации GSTM1 и GSTT1 является следствием обширной делеции в соответствующем гене [11].

Статистическая обработка данных.

Статистическую обработку данных, в том числе корреляционный и регрессионный анализ, проводили при помощи пакета прикладных программ STATISTICA 6.0. С использованием критерия Шапиро-Уилка был выявлен ненормальный характер распределения выборки и в дальнейшем оценку статистической значимости различий между группами проводили при помощи непараметрического U-критерия Манна-Уитни и критерия χ2 с поправкой Йетса для непрерывной вариации.

Результаты и обсуждения

В ответ на воздействие химических канцерогенов окружающей среды и образовании их аддуктов в эпителии бронхов и желудочно-кишечного тракта иммунная система реагирует в первую очередь индукцией IgA-АТ. О выраженности местной иммунной реакции можно судить по уровню сывороточных гаптен-специфических IgA-АТ. Очевидно, что дальше развивается системный иммунный ответ – индукция IgG-АТ.

С использованием регрессионного анализа исследовали взаимосвязи уровней IgG-АТ к БП и стероидным гормонам с уровнями IgA-АТ к БП. Результаты выражали ввиде уравнений общего вида y=a×x+b, где x – уровни IgA-БП, y – уровни IgG-БП, IgG-ЭС и IgG-ПГ; коэффициент а показывает, как изменяется y при изменении x.

Выяснилось, что между исследуемыми показателями действительно имеются статистически достоверные линейные взаимосвязи разной степени выраженности (коэффициенты корреляции r=0,35 – 0,7). Результаты представлены в табл. 1-4.

При анализе искомых взаимосвязей в двух сравниваемых группах без учёта ассоциации с генетическими полиморфизмами CYP и GST обнаружили следующее (табл.1). У женщин с ФБ коэффициент а в уравнении регрессии, описывающем взаимосвязь уровней IgG-ЭС и IgA-БП, больше, чем значение а во взаимосвязях IgG-БП/IgA-БП и IgG-ПГ/IgA-БП (соответственно: 0,62; 0,49; 0,35). Это означает, что при повышении уровня IgA-БП образование IgG-ЭС происходит более интенсивно, чем IgG-БП и IgG-ПГ. У женщин с ВПРП коэффициент а в уравнении IgG-БП/IgA-БП значительно больше, а в уравнениях IgG-ЭС/IgA-БП и IgG-ПГ/IgA-БП меньше, чем в норме. Эти различия наглядно продемонстрированы на рис.1.

Таблица 1

Взаимосвязи уровней IgG-АТ к бензо[а]пирену, эстрадиолу и прогестерону с уровнями IgA-АТ к бензо[а]пирену у женщин с физиологической беременностью (ФБ) и с врождёнными пороками развития плода (ВПРП)

Рис. 1. Зависимость уровней IgG-антител к бензо[а]пирену и эстрадиолу от уровней IgA-антител к бензо[а]пирену у женщин с физиологической беременностью (ФБ) и с врождёнными пороками развития плода (ВПРП)

Различия между группами особенно выражены при определённых генетических вариантах ферментов биотрансформации. Например, у гомозигот А/А гена CYP1A2*1F при наличии ВПРП значение а в 5 раз больше, чем в норме (соответственно 1,76 и 0,35), и в 4 раза больше при отсутствии делеции в гене GSTM1 (1,03 и 0,24) в уравнениях регрессии между IgG-БП и IgA-БП (табл. 2).

Таблица 2

Взаимосвязи уровней IgG-АТ к бензо[а]пирену (у) с уровнями IgA-АТ к бензо[а]пирену (х) у женщин с физиологической беременностью (ФБ) и с врождёнными пороками развития плода (ВПРП) при различных полиморфных вариантах генов ферментов биотрансформации

Особенно интересны различия внутри обследованных групп между носителями разных вариантов одного гена. Например, у женщин с ФБ при делеции GSTM1 значение а в 7 раз выше, чем у женщин без делеции в уравнениях регрессии между IgG-ЭС и IgA-БП (табл. 3) и между IgG-ПГ и IgA-БП (табл. 4). У женщин с ВПРП – гомозигот A/A CYP1A2*1F значения а в 2-3 раза выше, чем при наличии аллели С, при анализе взаимосвязей IgG-БП, IgG-ЭС и IgG-ПГ с IgA-БП (табл. 2-4).

Таблица 3

Взаимосвязи уровней IgG-АТ к эстрадиолу (у) с уровнями IgA-АТ к бензо[а]пирену (х) у женщин с физиологической беременностью (ФБ) и с врождёнными пороками развития плода (ВПРП) при различных полиморфных вариантах генов ферментов биотрансформации

Таблица 4

Взаимосвязи уровней IgG-АТ к прогестерону (у) с уровнями IgA-АТ к бензо[а]пирену (х) у женщин с физиологической беременностью (ФБ) и с врождёнными пороками развития плода (ВПРП) при различных полиморфных вариантах генов ферментов биотрансформации

Таким образом, получены подтверждения предположений [1] о том, что:

• Образование АТ к низкомолекулярным органическим ксено- и эндобиотикам в естественных условиях у человека – взаимосвязанные процессы;
• В норме эти процессы сбалансированы определённым образом (в частности, при беременности состояние иммунологического баланса описывается вышеприведёнными уравнениями регрессии);
• При нарушениях адаптации организма к генотоксическим ксенобиотикам имеет место иммунологических дисбаланс (в частности, при тератогенезе это явление описывается характерными уравнениями регрессии);
• Состояние иммунологической адаптации и дисбаланса ассоциированы с определёнными вариантами ферментов биотрансформации низкомолекулярных органических соединений.

Работа выполнена в рамках проекта № 59.1.1. Программы фундаментальных научных исследований СО РАН и поддержана грантом программы «УМНИК» по Кемеровской области.

Авторы благодарят сотрудников лаборатории иммуногенетики ИЭЧ СО РАН О.С. Попову, И.В. Шаталину за техническую поддержку настоящей работы.

Рецензенты:

Лавряшина М.Б., д.б.н., профессор кафедры генетики биологического факультета ФГБОУ ВПО «Кемеровский государственный университет», г. Кемерово;

Неверова О.А., д.б.н., профессор, заведующая лабораторией экологического биомониторинга ФГБУН Институт экологии человека Сибирского отделения РАН, г. Кемерово.

Работа поступила в редакцию 29.07.2014.

Библиографическая ссылка