Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Осиков М.В. 1 Телешева Л.Ф. 1 Кишкин А.М. 1 Федосов А.А. 1

---

1 ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России

Плейотропные эффекты эритропоэтина (ЭПО) являются объектом пристального изучения многих научных групп. ЭПО может обладать иммунотропными эффектами в ранние сроки термической травмы (ТТ), когда его действие не связано со стимуляцией эритро- и миелопоэза. Работа выполнена на 66 белых нелинейных половозрелых крысах. ТТ моделировали при контакте кожи в течение 30 с с нагретым до температуры 100 °С предметом (ожог IIIА степени), площадь ожога составляла около 4 %. ЭПО («Рекормон», МНН: эпоэтин бэта, «Roche», Швейцария) вводился внутрибрюшинно, начиная с 1 суток, ежедневно в дозе 500 МЕ/кг массы в течение 5 дней. Контрольной группе животных с ТТ вводилось эквиобъемное количество стерильного физиологического раствора. Исследования проводили на 1, 2, 3, 4, 5 сутки. В периферической крови общепринятыми методами определяли количество лейкоцитов и лейкоцитарную формулу, функциональную активность фагоцитов оценивали по поглощению частиц монодисперсного (диаметр 1,7 мкм) полистерольного латекса с учетом активности фагоцитоза, интенсивности фагоцитоза и фагоцитарного числа; кислород-зависимый метаболизм фагоцитов исследовали в спонтанном и индуцированном тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тесте) с учетом активности и интенсивности. Установлено, что при экспериментальной ТТ на 2–4 сутки наблюдается лейкопения, обусловленная снижением количества лимфоцитов, моноцитов, сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови, к 5 суткам нормализуется только количество нейтрофилов, сохраняется лимфоцитопения и моноцитопения, на 1–5 сутки ТТ увеличивается поглотительная способность и кислород-зависимый метаболизм фагоцитирующих клеток в периферической крови. Применение ЭПО при экспериментальной ТТ приводит к снижению выраженности лейкопении на 2–4 сутки наблюдения за счет увеличения представительства в периферической крови сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов. ЭПО уменьшает количество активных фагоцитов и способность отдельного фагоцита к генерации активных кислородных метаболитов в спонтанном и индуцированном режимах на 4–5 сутки и не оказывает влияния на поглотительную способность фагоцитов.

Статья в формате PDF

303 KB

эритропоэтин

врожденный иммунитет

термическая травма

1. Осиков М.В. Анализ эфферентных свойств церулоплазмина и альфа-1-кислого гликопротеина при экспериментальном перитоните / М.В. Осиков, Л.В. Кривохижина, А.В. Мальцев // Эфферентная терапия. – 2006. – Т. 12, № 4. – С. 36–39.

2. Осиков М.В. Влияние альфа-1-кислого гликопротеина на процессы свободнорадикального окисления при экспериментальной печеночной недостаточности / М.В. Осиков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т. 144, № 7. – С. 29–31.

3. Осиков М.В. Роль эритропоэтина в коррекции нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев // Фундаментальные исследования. – 2011. – № 9–3. – С. 462–466.

4. Осиков М.В. Эфферентные и антиоксидантные свойства эритропоэтина при хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, Ю.И. Агеев // Эфферентная терапия. – 2011. – Т. 17, № 4. – С. 7–13.

5. Осиков М.В. Влияние эритропоэтина на функциональную активность тромбоцитов / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, А.А. Федосов, Д.А. Козочкин, М.А. Ильиных // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 6; URL: www.science-education.ru/106-7450 (дата обращения: 25.04.2014).

6. Осиков М.В. К вопросу о механизме влияния эритропоэтина на аффективный статус у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М.В. Осиков, К.В. Ахматов, А.А. Федосов // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 7–1. – С. 140–145.

7. Jin W. Erythropoietin administration modulates pulmonary Nrf2 signaling pathway after traumatic brain injury in mice/ W. Jin, J. Wu, H. Wang // J. Trauma. – 2011. – Vol. 71(3). – P. 680–686.

8. Katavetin P. Antioxidative effects of erythropoietin / P. Katavetin, K. Tungsanga, S. Eiam-Ong // Kidney Int. Suppl. – 2007. – Vol. 107. – P. 10–15.

9. Kristal B. Epoetin-alpha: preserving kidney function via attenuation of polymorphonuclear leukocyte priming / B. Kristal, R. Shurtz-Swirski, O. Tanhilevski et al. // Origin. Articles. – 2008. – Vol. 10. – P. 266–272.

10. Lisowska K.A. Erythropoietin receptor is expressed on human peripheral blood T and B lymphocytes and monocytes and is modulated by recombinant human erythropoietin treatment / K.A. Lisowska, A. Debska-Slizień, E. Bryl et al. // Artif. Organs. – 2010. – Vol. 34(8). – P. 654–62.

11. Maiese K. Erythropoietin: elucidating new cellular targets that broaden therapeutic strategies / K. Maiese, Z.Z. Chong, F. Li, Y.C. Shang // Prog. Neurobiol. – 2008. – Vol. 85(2). – P. 194–213.

12. Schwacha M.G. Burn enhances toll-like receptor induced responses by circulating leukocytes / M.G. Schwacha, Q. Zhang, M. Rani, Craig T. et al. // Int. J. Clin. Exp. Med. – 2012. – Vol. 5(2). – P. 136–144.

13. Sener G. 2-Mercaptoethane sulfonate (MESNA) protects against burn-induced renal injury in rats / G. Sener, O. Sehirli, G. Erkanli et al. // Burns. – 2004. – Vol. 30(6). – P. 557–64.

14. Wang Y. The prognostic implication of determination of activation of leucocyte in severe burns / Y. Wang, K. Zhao, X. Wu // Zhonghua Zheng Xing Shao Shang Wai Ke Za Zhi. – 1994. – Vol. 10(4). – P. 286–289.

15. Zhang, J. Recombinant human erythropoietin (rhEPO) alleviates early brain injury following subarachnoid hemorrhage in rats: possible involvement of Nrf2-ARE pathway / J. Zhang, Y. Zhu, D. Zhou // Cytokine. – 2010. – Vol. 52, № 3. – P. 252–257.

В настоящее время достаточно распространенной разновидностью травматических повреждений кожи является термическая травма (ТТ). Результаты многочисленных отечественных и международных эпидемиологических исследований свидетельствуют о неуклонном росте числа обожженных больных с определенными различиями в зависимости от расы, пола, возраста, региона проживания; в РФ в 2009 году ожоги зарегистрированы у 313,5 тыс. человек, их распространенность не имеет тенденции к уменьшению; по данным ВОЗ, термические поражения занимают 3 место среди других травм, в РФ на долю ТТ приходится 10–11 %. Изменение иммунореактивности при ТТ является ключевым звеном развития гнойно-септических осложнений, неэффективной репарации и др. неблагоприятных последствий. Одной из актуальных задач современной медицинской науки является поиск эффективных средств фармакологической коррекции метаболических, функциональных и структурных изменений в организме при различных заболеваниях человека. Особый интерес в этом отношении вызывают лекарственные препараты, созданные на основе эндогенных регуляторов гомеостаза. Ранее нами были продемонстрированы протекторные свойства церулоплазмина и альфа-1-кислого гликопротеина [1, 2]. Эритропоэтин (ЭПО) – гликопротеин, эритропоэтические свойства которого известны с 1906 года, когда Р. Carnot и J.W. Deflandre продемонстрировали, что плазма крови экспериментальных животных после кровопотери содержит фактор, вызывающий ретикулоцитоз у интактных животных. Современные представления о механизмах действия ЭПО на молекулярном уровне позволяют отнести его одновременно к гормонам, факторам роста и цитокинам [11]. Основной точкой приложения для действия ЭПО являются клетки эритроидного ряда в костном мозге, на которых имеются специфические рецепторы. Открытие рецепторов ЭПО на клетках неэритроидных тканей, таких как нейроны, кардиомиоциты, клетки почек, эндотелиоциты позволило обнаружить новые биологические эффекты ЭПО [3, 5, 6]. В последние годы внимание многих исследователей сосредоточено на негемопоэтических, плейотропных эффектах ЭПО, а обнаружение экспрессии гена рецепторов ЭПО и мРНК рецепторов ЭПО в различных популяциях лейкоцитов позволяет предположить иммунотропные эффекты ЭПО. Цель работы – исследовать влияние эритропоэтина на показатели врожденного иммунитета в ранние сроки экспериментальной термической травмы.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на 66 белых нелинейных крысах массой 180–220 г. находящихся в стандартных условиях вивария на типовом рационе в соответствии с нормами, утвержденными Приказом Минздрава СССР № 1179 от 10.10.1983 г., при свободном доступе к пище и воде при 12–14-часовом световом дне. Все манипуляции с экспериментальными животными выполнялись в соответствии с правилами гуманного отношения к животным, методическими рекомендациями по их выведению из опыта и эвтаназии, регламентированными «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ СССР № 775 от 12.08.1977 г.) и положениями Хельсинской Декларации ВОЗ (1997). Для создания модели ТТ использовали плоскодонный стеклянный стакан из химического стекла с диаметром дна 4 см, наполненный дистиллированной водой с температурой 100 °С, время контакта с кожей для моделирования ТТ ІІІА степени составило 30 с. Площадь ожога вычисляли по формуле площади круга, в нашем эксперименте она составила 12,56 см². Для расчета поверхности тела у крыс использовали формулу Мее-Рубнера в модификации Lee:

S = К∙W ^0,6,

где S – поверхность тела в квадратных сантиметрах; К – коэффициент, равный 12,54; W – вес животного в граммах. Площадь поверхности тела животных в нашем эксперименте составила 336,44 ± 12,67 см². Так как абсолютная площадь ожога была одинаковой во всех случаях (12,56 см²), то относительная площадь ожога составила 3,97 ± 0,14 %, т.е. около 4 %. ЭПО в составе препарата «Рекормон» (МНН: эпоэтин бэта, «Roche», Швейцария) вводился внутрибрюшинно, начиная с 1 суток, ежедневно в дозе 500 МЕ/кг массы в течение 5 дней, суммарная доза 2500 МЕ/кг. Контрольной группе животных с ТТ вводилось эквиобъемное количество стерильного физиологического раствора. Исследования проводили на 1, 2, 3, 4, 5 сутки.

Количество лейкоцитов в периферической крови и лейкоцитарную формулу определяли общепринятыми методами, лейкоформулу рассчитывали в абсолютных (109/л) величинах. Исследование поглотительной способности лейкоцитов периферической крови проводили на модели поглощения частиц монодисперсного (диаметр 1,7 мкм) полистерольного латекса. С помощью иммерсионной микроскопии учитывали активность фагоцитоза (ФА) – % клеток, захвативших хотя бы одну частицу латекса, интенсивность фагоцитоза (ФИ) – число поглощенных микросфер латекса в 100 подсчитанных клетках и фагоцитарное число (ФЧ) – число поглощенных микросфер латекса на один фагоцит. Исследование кислород-зависимого метаболизма фагоцитов периферической крови проводили, учитывая интенсивность восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) в его нерастворимую форму – диформазан по методу А.Н. Маянского и М.Е. Виксмана (1979). Проводили спонтанный и индуцированный НСТ-тест (НСТТ) с учетом активности (% клеток) и интенсивности (у.е.). Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows v.10.0. Проверку статистических гипотез проводили с использованием критериев Краскела ‒ Уоллиса, Манна ‒ Уитни, Вальда ‒ Вольфовитца.

Результаты исследования и их обсуждение

При экспериментальной ТТ изменяется количественный состав лейкоцитов в периферической крови (табл. 1, 2). Общее количество лейкоцитов снижается в 1 сутки на правах тенденции, на 2–4 сутки – статистически значимо, к 5 суткам количество лейкоцитов не отличалось от группы интактных животных. При анализе лейкоцитарной формулы установлено, что на 1 сутки увеличивается количество палочкоядерных нейтрофилов, лейкопения на 2–4 сутки обусловлена снижением количества сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов, на 5 сутки количество нейтрофилов не отличалось от группы интактных животных, сохранялась лимфоцитопения и моноцитопения. Преимущественно снижалось количество лимфоцитов (на 88,5; 85,6; 93,5 % соответственно на 2, 3 и 4 сутки) и моноцитов (на 80,0; 81,3; 90,7 % соответственно), в меньшей степени – нейтрофилов (на 56,2; 49,0; 76,5 % соответственно). Увеличение количества палочкоядерных нейтрофилов на 1 сутки ТТ может быть связано с выходом этой популяции нейтрофилов из костномозгового пула. Полагаем, что снижение количества фагоцитов в периферической крови на 2–4 сутки связано с выходом этих клеток первой линии обороны в очаг повреждения, восстановление количества нейтрофилов к 5 суткам связано с результатом реакции миелоидного ростка костного мозга на стимулирующие воздействия из очага повреждения. Развитие лимфоцитопении может быть обусловлено как выходом лимфоцитов в очаг термического повреждения (в меньшей степени, учитывая ранние сроки наблюдения), так и активацией гибели лимфоцитов в кровотоке.

Таблица 1

Влияние эритропоэтина на количественный состав лейкоцитов на 1-3 сутки экспериментальной термической травмы (M ± m)

Примечание. Здесь и далее * - статистически значимые (р < 0,05) различия с группой интактных животных, # - с группой контроля.

Таблица 2

Влияние эритропоэтина на количественный состав лейкоцитов на 4-5 сутки экспериментальной термической травмы (M ± m)

При ТТ зафиксировано увеличение поглотительной способности и активация кислород-зависимого метаболизма фагоцитов (табл. 3, 4). Активность фагоцитоза значимо не изменяется во все сроки наблюдения, отметим, что, несмотря на снижение представительства фагоцитов в крови, % активно захватывающих частицы латекса клеток не уменьшился. Более того, на 1–5 сутки наблюдения возросла поглотительная активность отдельно взятого фагоцита по показателям интенсивности фагоцитоза и фагоцитарного числа. Кислород-зависимый метаболизм фагоцитов, оцениваемый в спонтанном НСТ-тесте, возрастал во все сроки наблюдения, при этом увеличивалось как количество активных клеток, так и способность к генерации активных кислород-содержащих метаболитов отдельной клеткой. Функциональный резерв фагоцитов, косвенно презентируемый показателями индуцированного НСТ-теста, также возрастал на 1–5 сутки наблюдения.

Показано, что активация циркулирующих фагоцитов при ТТ, особенно на 3–7 сутки, связана с Толл-подобными рецепторами (TLR), особенно TLR-2 и TLR-4 [12]. Гиперергия нейтрофилов после ТТ может лежать в основе повреждения многих органов и систем, развития синдрома полиорганной недостаточности за счет воздействия кислородных радикалов и ферментов лизосомального происхождения [13]. Избыточная активация нейтрофилов, повышение ими продукции АФК и ферментов имеют определяющее значение в повышении проницаемости сосудов не только in situ, но и отдаленно и приводить к развитию отеков тканей и органов после ТТ. В эксперименте показана прогностическая роль мониторинга НСТ-теста после ТТ: выживаемость выше, если первоначально НСТ-тест повышается, а затем постепенно снижается, непрерывный рост НСТ-теста приводит к неблагоприятным исходам [14].

Таблица 3

Влияние эритропоэтина на функциональную активность фагоцитов
на 1–3 сутки экспериментальной термической травмы (M ± m)

Таблица 4

Влияние эритропоэтина на функциональную активность фагоцитов
на 4–5 сутки экспериментальной термической травмы (M ± m)

Применение при экспериментальной ТТ ЭПО приводит к повышению общего количества лейкоцитов на 2–4 сутки эксперимента, снижению выраженности лейкопении в ранние сроки ТТ (табл. 1, 2). Эффект ЭПО проявился за счет увеличения количества сегментоядерных нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов (на 2 сутки эксперимента), увеличения количества моноцитов (на 3 сутки), увеличения количества сегментоядерных нейтрофилов и лимфоцитов (на 4 сутки). ЭПО изменяет функциональную активность фагоцитов при экспериментальной ТТ (табл. 3, 4). Наиболее значимо эффект ЭПО проявился в отношении кислород-зависимого метаболизма фагоцитов на 4 и 5 сутки эксперимента: снижались активность и интенсивность спонтанного и индуцированного НСТ-теста, значения показателей приближались к соответствующим значениям в группе интактных животных. Нами не обнаружено статистически
значимого влияния ЭПО на поглотительную способность фагоцитов при экспериментальной ТТ во все сроки наблюдения.

Полагаем, что ЭПО обладает прямым специфическим действием на фагоциты в периферической крови, т.к. с использованием метода проточной цитометрии и обратной ПЦР были обнаружены экспрессия гена EPOR и мРНК EPOR на различных популяциях лейкоцитов [10]. Kristal B. et al. приводят данные о том, что ЭПО вызывает снижение продукции супероксид-анион-радикала in vivo и ex vivo и увеличивает стабильность (срок жизни) нейтрофилов in vitro. На системном уровне ЭПО снижает количество лейкоцитов за счет нейтрофилов и уровень щелочной фосфатазы плазмы [9]. Ранее нами был продемонстрирован антиоксидантный эффект ЭПО в плазме и в тромбоцитах у больных с терминальной стадией ХПН [4]. Полагают, что ЭПО может оказывать антиоксидантный эффект за счет активации внутриклеточных механизмов, в том числе в фагоцитирующих клетках, таких как гемоксигеназа-1 и глютатионпероксидаза, также может снижать внутриклеточное содержание железа (II) [8]. Вскрыты и более интимные механизмы прямого антиоксидантного действия ЭПО, который реализуется посредством активации антиоксидантного транскрипционного ядерного фактора-2 и, как следствие, изменением активности НАД(Ф)Н-оксидоредуктазы, глутатион-S-трансферазы α-1 и гемоксигеназы-1, что позволило авторам обозначить ЭПО как фактор с антиоксидантным и дезинтоксикационным действием [7, 15].

Выводы

1. При экспериментальной термической травме на 2–4 сутки наблюдается лейкопения, обусловленная снижением количества лимфоцитов, моноцитов, сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови, к 5 суткам нормализуется только количество нейтрофилов, сохраняется лимфоцитопения и моноцитопения.
2. При оценке функциональной активности фагоцитов установлено, что на 1–5 сутки термической травмы увеличиваются поглотительная способность и кислород-зависимый метаболизм фагоцитирующих клеток в периферической крови.
3. Применение ЭПО при экспериментальной термической травме приводит к снижению выраженности лейкопении на 2–4 сутки наблюдения за счет увеличения представительства в периферической крови сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов.
4. ЭПО при экспериментальной термической травме уменьшает количество и способность отдельного фагоцита к генерации активных кислородных метаболитов в спонтанном и индуцированном режимах на 4–5 сутки и не оказывает влияния на поглотительную способность фагоцитов.

Рецензенты:

Гизингер О.А., д.б.н., профессор кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии, клинической лабораторной диагностики, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск;

Цейликман В.Э., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биологической химии, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск.

Работа поступила в редакцию 07.05.2014

Библиографическая ссылка