Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Хаитова З.К. 1 Уразова О.И. 1 Хасанова Р.Р. 1 Есимова И.Е. 1 Новицкий В.В. 1 Воронкова О.В. 1

---

1 ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Томск

В настоящей работе показано, что у больных туберкулезом легких на дендритных клетках (DC) и Т-лимфоцитах отмечается дефицит поверхностных молекул, участвующих в формировании иммунологического синапса, в результате чего возможны нарушения межклеточных взаимодействий и иммунного ответа. В работе был исследован иммунофенотип DC и Т-лимфоцитов. Было показано, что уровень экспрессии костимуляторных молекул (CD80, CD86) на поверхности DC у больных туберкулезом легких был снижен по сравнению со здоровыми донорами. При сравнении не было выявлено различий по уровню экспресии молекул HLA на поверхности DC у больных туберкулезом легких и группы здоровых доноров. Количество Т-лимфоцитов, несущих молекулу CD3, CD28, было снижено у больных туберкулезом легких, также у больных устанавливалось резкое уменьшение процентного числа CD3+ CD28+ клеток, содержащих внутриклеточный IL-2, по сравнению с таковым в контрольной группе. Таким образом, при туберкулезе легких имеет место дефицит на DC и Т-лимфоцитах молекул, участвующих в формировании иммунологического синапса, следствием чего может быть нарушение межклеточных взаимодействий, реализации индуктивной фазы иммунного ответа и, как результат, недостаточность IL-2-синтетической функции Т-клеток. По-видимому, данные нарушения связаны с длительной персистенцией микобактериального антигена в организме больных и непосредственным негативным влиянием M.tuberculosis на иммунокомпетентные клетки.

Статья в формате PDF

283 KB

дендритные клетки

Т-лимфоциты

иммунологический синапс

молекулы костимуляции

туберкулез

1. Ивашкин В.Т. Основные понятия и положения фундаментальной иммунологии / В.Т. Ивашкин // РЖГГК. – 2008. – № 4. – С. 4–13

2. К вопросу о патологии иммунитета при туберкулезе легких / В.В. Новицкий, О.В. Воронкова, О.И. Уразова и др. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2008. – № 1. – С. 15–18.

3. Новицкий В.В., Уразова О.И. Дизрегуляционная патология кроветворной и иммунной систем при инфекционном процессе // Успехи физиологических наук. – 2004. – Т. 35, № 1. – С. 43–52.

4. Особенности иммунного дисбаланса при различных клинико-патогенетических вариантах остропрогрессирующего туберкулеза легких / О.И. Уразова, В.В. Новицкий, Е.Г. Чурина и др. // Бюллетень сибирской медицины. – 2010. – № 3. – С. 42–50.

5. Причины дизрегуляции иммунного ответа при туберкулезе легких: влияние M. tuberculosis на течение иммунитета / И.Е. Есимова, В.В. Новицкий, О.И. Уразова и др. // Бюллетень сибирской медицины. – 2012. – № 3. – С. 79–86.

6. Реактивность иммунокомпетентных клеток при туберкулезе легких: молекулярно-генетическое исследование / О.И. Уразова, В.В. Новицкий, О.В. Воронкова и др. // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2010. – № 4. – С. 104–107.

7. Роль дендритных клеток в противотуберкулезном иммунитете / З.К. Хаитова, Р.Р. Хасанова, О.И. Воронкова и др. // Российский иммунологический журнал. – 2012. – Т. 6(15), № 2. – С. 119–123.

8. Роль паттернраспознающих рецепторов во врожденном и адаптивном иммунитете / Р.М. Хаитов, М.В. Пащенков, Б.В. Пинегин // Иммунология. – 2009. – № 1. – С. 66–74.

9. Роль цитокинов в модуляции субпопуляционного состава лимфоцитов крови у больных туберкулезом легких / Р.Р. Хасанова, О.В. Воронкова, О.И. Уразова и др. // Туберкулез и болезни легких. – 2008. – Т. 85, № 3. – С. 31–35.

10. Сепиашвили Р.И. Иммунные синапсы: от теории к клинической практике / Р.И. Сепиашвили, И.П. Балмасов // Молекулярная медицина. – 2008. – № 1. – С. 14–22.

11. Субпопуляционный состав регуляторных Т-клеток крови у больных туберкулезом легких с множественной лекарственной устойчивостью // Е.Г. Чурина, В.В. Новицкий, О.И. Уразова и др. // Бюллетень сибирской медицины. – 2011. – № 4. – С. 183–186.

12. TOLL-подобные рецепторы и их адаптерные молекулы / А.И. Тухватуллин, Д.Ю. Логунов, Д.Н. Щербинин, М.М. Шмаров, Б.С. Нородицкий и др. // Биохимия. – 2010. – Т. 75, № 9. – С. 1224–1243.

13. Уразова О.И. Молекулярно-генетические факторы туберкулеза легких / О.И. Уразова // Бюллетень сибирской медицины. – 2010. – № 5. – С. 5–13.

14. Хомченко Дж.А. Роль дендритных клеток в иммунном ответе на Т-независимые антигены типа 2 // Биологические мембраны. – 2010. – Т. 27, № 4. – С. 307–313.

15. Mycobacterium tuberculosis Induces Differential Cytokine Production from Dendritic Cells and Macrophages with Divergent Effects on Naive T Cell Polarization / S.P. Hickman, J. Chan, P. Salgame // Journal of Immunology. – 2002. – Vol. 168. – P. 4636–4642. 

16. Liu K., Origin and development of dendritic cells / K. Liu, M.C. Nussenzweig // Immunol. Rev. – 2010. – Vol. 234, № 1. – P. 45–54.

Как известно, иммунный ответ - это многоуровневый и многокомпонентный процесс, протекающий с вовлечением большого числа иммунокомпетентных клеток (антигенпрезентирующих, регуляторных, эффекторных), взаимодействующих между собой посредством поверхностных молекул и секретируемых цитокинов. Клеточная кооперация является необходимым условием для формирования иммунного ответа против инфекционных патогенов, в частности Mycobacterium tuberculosis (МВТ). Ключевым моментом в запуске иммунного ответа против МВТ, определяющим дальнейшее течение и исход патологического процесса, является представление антигена Т-лимфоцитам антигенпрезентирующими клетками (APC) [11, 6]. Взаимодействие APC и Т-лимфоцитов происходит в структурированной зоне контакта между клетками с формированием иммунологического синапса, представляющего собой комплекс молекул адгезии, костимуляции и антигенного представления, обеспечивающего осуществление той или иной формы иммунологического распознавания и связанной с ним сигнализации [9]. В роли APC могут выступать макрофаги и дендритные клетки (DC). Уникальность DC опосредуется наличием многочисленных и разнообразных поверхностных структур, которые вовлекаются в процесс праймирования лимфоцитов и межклеточной кооперации [13]. Зрелые DC индуцируют Т-лимфоциты, при этом, чем выше степень зрелости DC и плотность экспрессируемых молекул для кооперации, тем прочнее и длительнее контакт между клетками. В последующем активированный Т-лимфоцит отделяется от DC и для выполнения своих эффекторных функций мигрирует в ткани [4].

Из литературных источников известно, что противоинфекционный иммунный ответ начинается с распознавания инфекционного патогена DC с помощью паттерн-распознающих рецепторов (PRR), взаимодействующих с патоген-ассоциированными паттернами [7, 15]. Помимо PRR (к которым относятся, в частности, Толл-подобные рецепторы - TLR) DC экспрессируют молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС или HLA), костимуляторные молекулы семейства В7 (CD80/CD86), синтезируют цитокины (IL-12, IL-18, IL-27 и др.). Данные молекулы необходимы для активации Т-лимфоцитов и запуска иммунного ответа [16].

Формирование иммунологического синапса необходимо для передачи двух основных сигналов, первый из которых несет информацию об антигене (производится за счет распознавания TCR-рецептором Т-лимфоцита комплекса антигена с молекулами главного комплекса гистосовместимости (в случае туберкулезной инфекции - МНС класса II)). При контакте CD3/TCR с комплексом «пептид-МНС» больше порогового времени наивная Т-клетка (Th0) активируется и претерпевает клональную пролиферацию и дифференцировку в эффекторные Т-клетки (Th1) или Т-клетки памяти. Данный процесс сопровождается качественным изменением набора поверхностных адгезивных молекул, которые направляют уже эффекторные Т-клетки из лимфоидных органов в места локализации патогена (барьерные ткани и очаги воспаления) [1].

Второй немаловажный активационный сигнал осуществляется за счет взаимодействия костимуляторных молекул В7 (CD80, CD86) на поверхности APC с молекулой CD28, конституционно представленной на поверхности всех покоящихся CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток. Биологический смысл взаимодействия В7 и CD28, по мнению исследователей, заключается в «подтверждении» сигнала активации, полученного Т-клеточным рецептором, и защите от аутоагрессии лимфоцитарными клонами, не прошедшими отрицательную селекцию в тимусе, поскольку сам факт распознавания антигена не является единственным условием запуска дифференцировки наивных Т-клеток. Считается, что именно через данное взаимодействие обеспечиваются, в первую очередь, усиление и продление сроков продукции IL-2, а также (в меньшей степени) секреция интерферона (IFN) γ Т-лимфоцитами [1, 5, 12].

Показано, что длительная персистенция микобактериального антигена приводит к дисфункции как со стороны APC, так и со стороны Т-лимфоцитов [2, 14]. В свою очередь, знание молекулярной природы нарушений взаимодействия основных клеток иммунной системы необходимо для более полного и глубокого понимания патогенеза туберкулезной инфекции, на котором базируются современные подходы к лечению иммунозависимых заболеваний, к которым относится, в частности, туберкулез легких.

Целью настоящей работы явилось исследование у больных туберкулезом легких иммунофенотипа DC и Т-лимфоцитов, а именно оценка экспрессии на клетках молекул, участвующих в образовании иммунологического синапса, и (по результатам определения внутриклеточного IL-2 - IL-2⁺клеток) IL-2-синтетической активности Т-лимфоцитов крови.

Материал и методы исследования

В исследовании DC получали путем трансформации in vitro из моноцитов периферической крови. Мононуклеарные клетки выделяли из гепаринизированной венозной крови путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина; фракции моноцитов и лимфоцитов разделяли путем центрифугирования в двойном градиенте плотности перколла. Изолированные моноциты отмывали средой RPMI-1640 и вносили в плоскодонные 24-луночные планшеты в количестве 1∙10⁶ клеток в 1 мл. Культивирование осуществляли в полной питательной среде, содержащей 10 %-ю эмбриональную телячью сыворотку, 50 мкг/мл пенициллина-стрептомицина, 0,29 мкг/мл L-глутамина с добавлением цитокинов (IL-4 и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора роста (GM-CSF)) («Sigma», США), при 37 °С в СО₂-инкубаторе в течение 7 дней. Замена полной питательной среды производилась на 3-и и 5-е сутки. Дополнительно на 5-е сутки клетки стимулировали липополисахаридом («Sigma», USA). Исследование DC проводили с помощью микроскопа фирмы Carl Zeiss (Германия).

Культивирование лимфоцитов, выделенных на двойном градиенте плотности фиколл-урографина (1,077 и 1,083 г/см³), осуществляли в полной питательной среде с поэтапным добавлением в культуру клеток моноклональных антител к CD3- и CD28-молекулам («R&D Systems», США) и блокатора внутриклеточного транспорта монензина («Sigma», США). Образцы инкубировали в СО₂-инкубаторе при температуре 37 °С. Общее время инкубации составило 12 ч. Процедуру окрашивания поверхностных молекул (CD3, CD28) и внутриклеточного аналита (IL-2) осуществляли согласно протоколам фирмы производителя («R&D Systems», США).

Иммунофенотипирование трансформированных зрелых DC и лимфоцитов крови проводили методом проточной цитометрии на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием моноклональных антител, меченных флуресцентными красителями (FITC, PE, PerCP), и изотипических контролей («R&D Systems», США). Анализ полученных данных осуществляли при помощи программного приложения BD Cell CellQuest for Mac OS® X.

Обработку полученных результатов проводили на основе общепринятых статистических методов с помощью программы SPSS 11.5 for Windows. Различия между независимыми выборками оценивали с помощью критерия Стьюдента или Манна-Уитни, достоверность рассчитывали при р < 0,05. Данные представляли в виде медианы и квартилей Mе (Q₁-Q₂).

В ходе эксперимента было показано, что уровень миелоидных DC, экспрессирующих HLA-DR, у больных туберкулезом легких (ТЛ) статистически не отличался от такового в группе контроля. Однако процентное содержание трансформированных из моноцитов периферической крови DC, несущих одну из костимуляторных молекул семейства В7 - CD80⁺ и CD86⁺ DC, у больных ТЛ было значимо ниже контрольных значений - в 26,7 и 2,3 раза соответственно. При этом относительная численность DC, одновременно экспрессирующих на своей поверхности обе молекулы (CD80⁺ CD86⁺DC), у больных ТЛ оказалась в 1,6 раза ниже аналогичного показателя у здоровых доноров (таблица).

Исследование иммунофенотипа Т-лимфоцитов у больных туберкулезом легких позволило зарегистрировать снижение (в 1,4 раза) общего количества клеток, несущих поверхностный маркер CD3 (CD3/TCR⁺⁾, по сравнению с аналогичным параметром у здоровых доноров (см. таблицу). Наряду с этим, в группе обследованных лиц с туберкулезной инфекцией отмечалось уменьшение (практически в 2 раза по сравнению с нормой) числа лимфоцитов, экспрессирующих молекулу CD28 (таблица). Кроме того, у больных ТЛ устанавливалось резкое снижение процентного числа CD3⁺ CD28⁺ клеток, содержащих внутриклеточный IL-2, по сравнению с таковым в контрольной группе (см. таблицу).

Фенотипическая характеристика Т-лимфоцитов и зрелых миелоидных дендритных клеток, трансформированных из моноцитов периферической крови, у здоровых и больных туберкулёзом лёгких, Ме (Q1-Q3)

Примечание: Р - уровень статистической значимости различий по сравнению с показателями у здоровых доноров.

Полученные нами результаты свидетельствуют о недостаточной функциональной активности как DC, так и Т-лимфоцитов у больных ТЛ. Как указывалось ранее, CD3/TCR-молекулы необходимы для восприятия информации об антигене от DC и включения первого сигнала активации Т-клеток. Снижение общего числа CD3/TCR-позитивных лимфоцитов, вероятно, является главной причиной дизрегуляции иммунного ответа на МВТ и может быть связано с нарушением процессов пролиферации Т-клеток и их гибелью путем запуска программы апоптоза [2, 6, 9, 10].

Мы уже отмечали ранее, что костимуляторные молекулы CD80 и CD86 с поверхности DC передают второй активационный сигнал на молекулу CD28 Т-лимфоцита, который в комплексе с сигналом от CD3/TCR через серию каскадных реакций приводит к активации транскрипционных факторов. Последние индуцируют экспрессию генов, ответственных за секрецию иммуноцитокинов и их рецепторов, необходимых для полноценной активации Т-лимфоцитов, их дифференцировки и клональной экспансии [6, 14]. Так, например, сигналы с молекул CD28 и TCR-рецептора являются определяющим фактором для активации транскрипции генов IL-2 (IL2) и IFNγ (IFNG). Установлено, что недостаточное или полное отсутствие взаимодействия CD28 с CD80/CD86 провоцирует формирование гипоэргии и анергии Т-лимфоцитов, приводящих в итоге к гипосекреции IL-2 - основного активирующего и ростового фактора для Т-клеток, и их гибели путем апоптоза [1, 6, 10, 12]. Механизм реализации апоптоза в данном случае зависит от экспрессии апоптотического фактора FasL в ответ на «неправильный» антигенный стимул, определяющей гибель наивного Т-лимфоцита [3, 4, 8, 11]. Вероятно, именно данный механизм лежит в основе выявленной нами Т-лимфоцитопении, о чем могут свидетельствовать низкие показатели численности CD28⁺ и CD3⁺CD28⁺IL-2⁺ лимфоцитов, а также CD80⁺, CD86⁺ и CD80⁺CD86⁺DC у больных ТЛ, установленные в настоящем исследовании (см. таблицу).

Кроме того, показано, что вирулентные микобактериальные штаммы обладают способностью ингибировать экспрессию костимуляторных молекул CD80, CD86 и, таким образом, отменять сигнал, «разрешающий» активацию Т-хелперных клеток, участвующих в реакциях клеточно-опосредованного иммунитета, что также вносит вклад в уменьшение численности Т-лимфоцитов. Обладающие плюрипотентностью DC способны не только активировать, но и подавлять Т-клеточные иммунные реакции в результате их альтернативной активации в присутствии Тh2-цитокинов. Одним из фенотипических признаков альтернативно активированных DC является низкая экспрессия молекул CD80, CD86. Подобный функциональный дефект DC может быть обусловлен как прямым воздействием МВТ, так и индуцируемой микобактериальными токсинами генерацией иммуносупрессорных DC из моноцитов, которые рекрутируются в очаг туберкулезной инфекции из периферической крови [4]. Вероятно, именно этим фактом можно объяснить установленное в настоящем исследовании уменьшение численности CD80⁺, CD86⁺и CD80⁺CD86⁺DC, трансформированных из моноцитов крови больных ТЛ (см. таблицу).

Таким образом, в ходе проведенного исследования показано, что при туберкулезе легких имеет место дефицит на DC и Т-лимфоцитах молекул, участвующих в формировании иммунологического синапса, следствием чего может быть нарушение межклеточных взаимодействий, реализации индуктивной фазы иммунного ответа и, как результат, недостаточность IL-2-синтетической функции Т-клеток. По-видимому, данные нарушения связаны с длительной персистенцией микобактериального антигена в организме больных и непосредственным негативным влиянием МВТ на иммунокомпетентные клетки.

Филинюк О.В., д.м.н., зав. кафедрой фтизиатрии и пульмонологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России, г. Томск:

Зима А.П., д.м.н., профессор кафедры молекулярной медицины и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России, г. Томск.

Работа поступила в редакцию 10.12.2012.

Библиографическая ссылка