Как известно, иммунный ответ - это многоуровневый и многокомпонентный процесс, протекающий с вовлечением большого числа иммунокомпетентных клеток (антигенпрезентирующих, регуляторных, эффекторных), взаимодействующих между собой посредством поверхностных молекул и секретируемых цитокинов. Клеточная кооперация является необходимым условием для формирования иммунного ответа против инфекционных патогенов, в частности Mycobacterium tuberculosis (МВТ). Ключевым моментом в запуске иммунного ответа против МВТ, определяющим дальнейшее течение и исход патологического процесса, является представление антигена Т-лимфоцитам антигенпрезентирующими клетками (APC) [11, 6]. Взаимодействие APC и Т-лимфоцитов происходит в структурированной зоне контакта между клетками с формированием иммунологического синапса, представляющего собой комплекс молекул адгезии, костимуляции и антигенного представления, обеспечивающего осуществление той или иной формы иммунологического распознавания и связанной с ним сигнализации [9]. В роли APC могут выступать макрофаги и дендритные клетки (DC). Уникальность DC опосредуется наличием многочисленных и разнообразных поверхностных структур, которые вовлекаются в процесс праймирования лимфоцитов и межклеточной кооперации [13]. Зрелые DC индуцируют Т-лимфоциты, при этом, чем выше степень зрелости DC и плотность экспрессируемых молекул для кооперации, тем прочнее и длительнее контакт между клетками. В последующем активированный Т-лимфоцит отделяется от DC и для выполнения своих эффекторных функций мигрирует в ткани [4].
Из литературных источников известно, что противоинфекционный иммунный ответ начинается с распознавания инфекционного патогена DC с помощью паттерн-распознающих рецепторов (PRR), взаимодействующих с патоген-ассоциированными паттернами [7, 15]. Помимо PRR (к которым относятся, в частности, Толл-подобные рецепторы - TLR) DC экспрессируют молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС или HLA), костимуляторные молекулы семейства В7 (CD80/CD86), синтезируют цитокины (IL-12, IL-18, IL-27 и др.). Данные молекулы необходимы для активации Т-лимфоцитов и запуска иммунного ответа [16].
Формирование иммунологического синапса необходимо для передачи двух основных сигналов, первый из которых несет информацию об антигене (производится за счет распознавания TCR-рецептором Т-лимфоцита комплекса антигена с молекулами главного комплекса гистосовместимости (в случае туберкулезной инфекции - МНС класса II)). При контакте CD3/TCR с комплексом «пептид-МНС» больше порогового времени наивная Т-клетка (Th0) активируется и претерпевает клональную пролиферацию и дифференцировку в эффекторные Т-клетки (Th1) или Т-клетки памяти. Данный процесс сопровождается качественным изменением набора поверхностных адгезивных молекул, которые направляют уже эффекторные Т-клетки из лимфоидных органов в места локализации патогена (барьерные ткани и очаги воспаления) [1].
Второй немаловажный активационный сигнал осуществляется за счет взаимодействия костимуляторных молекул В7 (CD80, CD86) на поверхности APC с молекулой CD28, конституционно представленной на поверхности всех покоящихся CD4+ и CD8+ Т-клеток. Биологический смысл взаимодействия В7 и CD28, по мнению исследователей, заключается в «подтверждении» сигнала активации, полученного Т-клеточным рецептором, и защите от аутоагрессии лимфоцитарными клонами, не прошедшими отрицательную селекцию в тимусе, поскольку сам факт распознавания антигена не является единственным условием запуска дифференцировки наивных Т-клеток. Считается, что именно через данное взаимодействие обеспечиваются, в первую очередь, усиление и продление сроков продукции IL-2, а также (в меньшей степени) секреция интерферона (IFN) γ Т-лимфоцитами [1, 5, 12].
Показано, что длительная персистенция микобактериального антигена приводит к дисфункции как со стороны APC, так и со стороны Т-лимфоцитов [2, 14]. В свою очередь, знание молекулярной природы нарушений взаимодействия основных клеток иммунной системы необходимо для более полного и глубокого понимания патогенеза туберкулезной инфекции, на котором базируются современные подходы к лечению иммунозависимых заболеваний, к которым относится, в частности, туберкулез легких.
Целью настоящей работы явилось исследование у больных туберкулезом легких иммунофенотипа DC и Т-лимфоцитов, а именно оценка экспрессии на клетках молекул, участвующих в образовании иммунологического синапса, и (по результатам определения внутриклеточного IL-2 - IL-2 + клеток) IL-2-синтетической активности Т-лимфоцитов крови.
Материал и методы исследования
В исследовании DC получали путем трансформации in vitro из моноцитов периферической крови. Мононуклеарные клетки выделяли из гепаринизированной венозной крови путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина; фракции моноцитов и лимфоцитов разделяли путем центрифугирования в двойном градиенте плотности перколла. Изолированные моноциты отмывали средой RPMI-1640 и вносили в плоскодонные 24-луночные планшеты в количестве 1∙106 клеток в 1 мл. Культивирование осуществляли в полной питательной среде, содержащей 10 %-ю эмбриональную телячью сыворотку, 50 мкг/мл пенициллина-стрептомицина, 0,29 мкг/мл L-глутамина с добавлением цитокинов (IL-4 и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора роста (GM-CSF)) («Sigma», США), при 37 °С в СО2-инкубаторе в течение 7 дней. Замена полной питательной среды производилась на 3-и и 5-е сутки. Дополнительно на 5-е сутки клетки стимулировали липополисахаридом («Sigma», USA). Исследование DC проводили с помощью микроскопа фирмы Carl Zeiss (Германия).
Культивирование лимфоцитов, выделенных на двойном градиенте плотности фиколл-урографина (1,077 и 1,083 г/см3), осуществляли в полной питательной среде с поэтапным добавлением в культуру клеток моноклональных антител к CD3- и CD28-молекулам («R&D Systems», США) и блокатора внутриклеточного транспорта монензина («Sigma», США). Образцы инкубировали в СО2-инкубаторе при температуре 37 °С. Общее время инкубации составило 12 ч. Процедуру окрашивания поверхностных молекул (CD3, CD28) и внутриклеточного аналита (IL-2) осуществляли согласно протоколам фирмы производителя («R&D Systems», США).
Иммунофенотипирование трансформированных зрелых DC и лимфоцитов крови проводили методом проточной цитометрии на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием моноклональных антител, меченных флуресцентными красителями (FITC, PE, PerCP), и изотипических контролей («R&D Systems», США). Анализ полученных данных осуществляли при помощи программного приложения BD Cell CellQuest for Mac OS® X.
Обработку полученных результатов проводили на основе общепринятых статистических методов с помощью программы SPSS 11.5 for Windows. Различия между независимыми выборками оценивали с помощью критерия Стьюдента или Манна-Уитни, достоверность рассчитывали при р < 0,05. Данные представляли в виде медианы и квартилей Mе (Q1-Q2).
Результаты исследования и их обсуждение
В ходе эксперимента было показано, что уровень миелоидных DC, экспрессирующих HLA-DR, у больных туберкулезом легких (ТЛ) статистически не отличался от такового в группе контроля. Однако процентное содержание трансформированных из моноцитов периферической крови DC, несущих одну из костимуляторных молекул семейства В7 - CD80+ и CD86+ DC, у больных ТЛ было значимо ниже контрольных значений - в 26,7 и 2,3 раза соответственно. При этом относительная численность DC, одновременно экспрессирующих на своей поверхности обе молекулы (CD80+ CD86+ DC), у больных ТЛ оказалась в 1,6 раза ниже аналогичного показателя у здоровых доноров (таблица).
Исследование иммунофенотипа Т-лимфоцитов у больных туберкулезом легких позволило зарегистрировать снижение (в 1,4 раза) общего количества клеток, несущих поверхностный маркер CD3 (CD3/TCR +), по сравнению с аналогичным параметром у здоровых доноров (см. таблицу). Наряду с этим, в группе обследованных лиц с туберкулезной инфекцией отмечалось уменьшение (практически в 2 раза по сравнению с нормой) числа лимфоцитов, экспрессирующих молекулу CD28 (таблица). Кроме того, у больных ТЛ устанавливалось резкое снижение процентного числа CD3+ CD28+ клеток, содержащих внутриклеточный IL-2, по сравнению с таковым в контрольной группе (см. таблицу).
Фенотипическая характеристика Т-лимфоцитов и зрелых миелоидных дендритных клеток, трансформированных из моноцитов периферической крови, у здоровых и больных туберкулёзом лёгких, Ме (Q1-Q3)
Параметры |
Группа исследования |
|
здоровые доноры (n = 25) |
больные туберкулезом легких (n = 50) |
|
Количество HLA-DR+ дендритных клеток, % |
90,73 (87,61-93,76) |
83,90 (81,31-94,35) |
Количество CD80+ дендритных клеток, % |
4,00 (2,25-5,75) |
0,15 (0-1,70) Р < 0,05 |
Количество CD86+ дендритных клеток, % |
63,81 (44,37-67,78) |
28,07 (22,57-36,20) Р < 0,05 |
Количество CD80+ CD86+ дендритных клеток, % |
30,10 (26,33-32,68) |
19,15 (11,50-22,90) Р < 0,05 |
Количество CD3(TCR) + лимфоцитов, % |
76,48 (71,27-82,29) |
56,70 (49,45-62,40) Р < 0,001 |
Количество CD28+ лимфоцитов, % |
33,13 (28,27-42,18) |
15,25 (10,17-19,69) Р < 0,001 |
Количество CD3+ CD28 + IL-2+ лимфоцитов, % |
18,88 (14,72-22,99) |
9,89 (6,90-13,85) Р < 0,001 |
Примечание: Р - уровень статистической значимости различий по сравнению с показателями у здоровых доноров.
Полученные нами результаты свидетельствуют о недостаточной функциональной активности как DC, так и Т-лимфоцитов у больных ТЛ. Как указывалось ранее, CD3/TCR-молекулы необходимы для восприятия информации об антигене от DC и включения первого сигнала активации Т-клеток. Снижение общего числа CD3/TCR-позитивных лимфоцитов, вероятно, является главной причиной дизрегуляции иммунного ответа на МВТ и может быть связано с нарушением процессов пролиферации Т-клеток и их гибелью путем запуска программы апоптоза [2, 6, 9, 10].
Мы уже отмечали ранее, что костимуляторные молекулы CD80 и CD86 с поверхности DC передают второй активационный сигнал на молекулу CD28 Т-лимфоцита, который в комплексе с сигналом от CD3/TCR через серию каскадных реакций приводит к активации транскрипционных факторов. Последние индуцируют экспрессию генов, ответственных за секрецию иммуноцитокинов и их рецепторов, необходимых для полноценной активации Т-лимфоцитов, их дифференцировки и клональной экспансии [6, 14]. Так, например, сигналы с молекул CD28 и TCR-рецептора являются определяющим фактором для активации транскрипции генов IL-2 (IL2) и IFNγ (IFNG). Установлено, что недостаточное или полное отсутствие взаимодействия CD28 с CD80/CD86 провоцирует формирование гипоэргии и анергии Т-лимфоцитов, приводящих в итоге к гипосекреции IL-2 - основного активирующего и ростового фактора для Т-клеток, и их гибели путем апоптоза [1, 6, 10, 12]. Механизм реализации апоптоза в данном случае зависит от экспрессии апоптотического фактора FasL в ответ на «неправильный» антигенный стимул, определяющей гибель наивного Т-лимфоцита [3, 4, 8, 11]. Вероятно, именно данный механизм лежит в основе выявленной нами Т-лимфоцитопении, о чем могут свидетельствовать низкие показатели численности CD28 + и CD3+ CD28+ IL-2+ лимфоцитов, а также CD80+ , CD86+ и CD80+ CD86+ DC у больных ТЛ, установленные в настоящем исследовании (см. таблицу).
Кроме того, показано, что вирулентные микобактериальные штаммы обладают способностью ингибировать экспрессию костимуляторных молекул CD80, CD86 и, таким образом, отменять сигнал, «разрешающий» активацию Т-хелперных клеток, участвующих в реакциях клеточно-опосредованного иммунитета, что также вносит вклад в уменьшение численности Т-лимфоцитов. Обладающие плюрипотентностью DC способны не только активировать, но и подавлять Т-клеточные иммунные реакции в результате их альтернативной активации в присутствии Тh2-цитокинов. Одним из фенотипических признаков альтернативно активированных DC является низкая экспрессия молекул CD80, CD86. Подобный функциональный дефект DC может быть обусловлен как прямым воздействием МВТ, так и индуцируемой микобактериальными токсинами генерацией иммуносупрессорных DC из моноцитов, которые рекрутируются в очаг туберкулезной инфекции из периферической крови [4]. Вероятно, именно этим фактом можно объяснить установленное в настоящем исследовании уменьшение численности CD80+, CD86 + и CD80 + CD86 + DC, трансформированных из моноцитов крови больных ТЛ (см. таблицу).
Заключение
Таким образом, в ходе проведенного исследования показано, что при туберкулезе легких имеет место дефицит на DC и Т-лимфоцитах молекул, участвующих в формировании иммунологического синапса, следствием чего может быть нарушение межклеточных взаимодействий, реализации индуктивной фазы иммунного ответа и, как результат, недостаточность IL-2-синтетической функции Т-клеток. По-видимому, данные нарушения связаны с длительной персистенцией микобактериального антигена в организме больных и непосредственным негативным влиянием МВТ на иммунокомпетентные клетки.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (ГК № 16.512.11.2046 от 14.02.2011 г.), РФФИ (Проект № 11-04-98057-р), Совета по грантам при Президенте РФ для ведущих научных школ (16.120.11.614-НШ) и на средства персонального гранта от компании ОПТЭК по поддержке молодых ученых 2012 г. (договор от № 8/11 КЦ от 10 апреля 2012 г.).
Рецензенты:
Филинюк О.В., д.м.н., зав. кафедрой фтизиатрии и пульмонологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России, г. Томск:
Зима А.П., д.м.н., профессор кафедры молекулярной медицины и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России, г. Томск.
Работа поступила в редакцию 10.12.2012.
Библиографическая ссылка
Хаитова З.К., Уразова О.И., Хасанова Р.Р., Есимова И.Е., Новицкий В.В., Воронкова О.В. ОСОБЕННОСТИ ИММУНОФЕНОТИПА ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК И Т-ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 12-2. – С. 386-390;URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=30908 (дата обращения: 17.08.2024).