Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Осиков М.В. 1 Григорьев Т.А. 2 Федосов А.А. 1

---

1 ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России», Челябинск

2 ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница», Челябинск

Исследована тромбоцитарно-клеточная кооперация в крови в условиях дефицита эндогенного эритропоэтина (ЭПО) (группа II, n = 24) и при введении экзогенного ЭПО (группа III, n = 38) у больных хронической почечной недостаточностью (ХПН), находящихся на постоянном лечении в отделении диализа ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница». Контрольная группа (группа I, n = 25) – клинически здоровые добровольцы. Рекомбинантный человеческий ЭПО в составе препарата «Рекормон» (МНН: эпоэтин бэта, «Roche», Швейцария) вводили в разовой дозе 2000–4000 МЕ, течение суммарная доза около 50000 МЕ. Тромбоцитарно-лейкоцитарные взаимодействия исследовали на проточном цитофлюориметре с использованием моноклональных антител, меченных CD41-FITC; CD61-FITC; CD42b-РЕ. Эритроцитарно-тромбоцитарные коагрегаты определяли в камере Горяева после перемешивания и инкубации суспензии эритроцитов и тромбоцитов. Установлено, что при ХПН увеличивается количество тромбоцитарно-нейтрофильных и тромбоцитарно-моноцитарных коагрегатов, уменьшается количество тромбоцитарно-лимфоцитарных и тромбоцитарно-эритроцитарных коагрегатов. Применение ЭПО приводит к частичной (взаимодействие тромбоцитов с моноцитами) или полной (взаимодействие тромбоцитов с нейтрофилами, лимфоцитами и эритроцитами) нормализации клеточной кооперации. Механизм действия ЭПО, в том числе, обусловлен увеличением количества эритроцитов в периферической крови.

Статья в формате PDF

291 KB

эритропоэтин

тромбоциты

кооперация клеток крови

хроническая почечная недостаточность

1. Осиков М.В. К патогенезу нарушений гемореологии при печеночной недостаточности и их коррекция церулоплазмином / М.В. Осиков, Л.В. Кривохижина // Тромбоз, гемостаз и реология. – 2005. – № 4. – С. 55–60.

2. Осиков М.В. Реактивные изменения клеточно-гуморальной системы организма как типовой патологический процессии его регуляция реактантами острой фазы : автореф. дис. … д-ра мед. наук. – Челябинск, 2008. – 44 с.

3. Осиков М.В. Анализ гематологических эффектов эритропоэтина у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на диализе / М.В. Осиков, Л.В. Кривохижина, К.В. Ахматов, В.Ю. Ахматов // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Cepия «Oбpaзовaниe, здpaвooxpaнeниe, физичecкaя кyльтypa». – 2009. –№20 (153), Вып. 19. – С. 79–82.

4. Осиков М.В. Влияние эритропоэтина на активность систем плазменного протеолиза при экспериментальной почечной недостаточности / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2012. – Т. 153, № 1. – С. 27–30.

5. Amer J. The antioxidant effect of erythropoietin on thalassemic blood cells / J. Amer, M. Dana, E. Fibach // Anemia. – 2010. – 978710. Epub 2010 Dec.

6. Bonomini M. Adherence of uremic erythrocytes to vascular endothelium decreases endothelial nitric oxide synthase expression / M. Bonomini, A. Pandolfi, N. Di Pietro et al. // Kidney Int. – 2005. – Vol. 67, № 5. – P. 1899–1906.

7. Borges, A. Apoptosis of peripheral CD4(+) T-lymphocytes in end-stage renal disease patients under hemodialysis and rhEPO therapies / A. Borges, M. Borges, J. Fernandes // Ren. Fail. – 2011. – Vol. 33, № 2. – P. 138–143.

8. Da Costa Martins, P. Platelet-monocyte complexes support monocyte adhesion to endothelium by enhancing secondary tethering and cluster formation / P. da Costa Martins, N. van den Berk, L.H. Ulfman et al. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2004. – Vol. 24, № 1. – P. 193–199.

9. Ehlers, R. Targeting Platelet-Leukocyte Interactions: Identification of the Integrin Mac-1 Binding Site for the Platelet Counter Receptor Glycoprotein Ib / R. Ehlers, V. Ustinov, Z. Chen et al. // J. Exper. Med. – 2003. – Vol. 198, № 7. – P. 1077–1088.

10. Goel M.S. Adhesion of normal erythrocytes at depressed venous shear rates to activated neutrophils, activated platelets, and fibrin polymerized from plasma / M.S. Goel, S.L. Diamond // Blood. – 2002. – Vol. 100, № 10. – P. 3797–3803.

11. Lisowska K.A. Flow cytometric analysis of STAT5 phosphorylation and CD95 expression in CD4(+) T lymphocytes treated with recombinanthuman erythropoietin / K.A. Lisowska, A. Dębska-Ślizień, A. Jasiulewicz // J. Recept. Signal. Transduct. Res. – 2011. – Vol. 31, № 3. – P. 241–246.

12. Pereira R. Neutrophil and monocyte activation in chronic kidney disease patients under hemodialysis and its relationship with resistance to recombinant human erythropoietin and to the hemodialysis procedure / R. Pereira, E. Costa,

M. Goncalves // Hemodial Int. – 2010. – Vol. 14, № 3. – P. 295–301.

13. Schramm R. Erythropoietin inhibits post-ischemic leukocyte adhesion but does not affect rejection in murine cardiac allografts / R. Schramm, S. Kirsch, H.J. Schäfers // J. Heart Lung. Transplant. – 2010. – Vol. 29, № 10. – P. 1185–1192.

14. Sirolli V. Platelet activation and platelet-erythrocyte aggregates in end-stage renal disease patients on hemodialysis / V. Sirolli, L. Strizzi, S. Di Stante et al. // Thromb. Haemost. – 2001. – Vol. 86, № 3. – P. 834–839.

15. Taoufik E. TNF receptor I sensitizes neurons to erythropoietin – and VEGF-mediated neuroprotection after ischemic and excitotoxic injury / E. Taoufik, E. Petit, D. Divoux et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2008. – Vol. 22, № 105. – Р. 6185–6190.

Эритропоэтин (ЭПО) секретируется в кровь пери- и тубулярными клетками почек в физиологических условиях, что обеспечивает его постоянный базальный уровень в крови, который в свою очередь значительно возрастает при адаптации к гипоксии, когда синтез и секреция ЭПО повышаются в десятки раз. Наличие ЭПО в крови обеспечивает его постоянный контакт с эндотелиоцитами и клетками крови. Рецепторы для ЭПО обнаружены на эндотелиальных клетках, можно предположить их наличие на клетках крови, в первую очередь, на различных популяциях лейкоцитов и тромбоцитах, учитывая, в том числе, тот факт, что многие протекторные эффекты ЭПО, особенно при токсическом и/или гипоксическом повреждении клеток, реализуются через рецептор-1 опухольнекротизирующего фактора, а также сопряжены с активацией субъединицы ?сR КСФ-ГМ, ИЛ-3, ИЛ-5 [15]. Это позволяет предположить вмешательство ЭПО в реализацию функциональной активности тромбоцитов, в том числе межклеточные взаимодействия, опосредованные изменением экспрессии адгезивных молекул, трансформацией мембранных фосфолипидов и др. факторами. Ранее нами продемонстрированы негемопоэтические эффекты ЭПО при хронической почечной недостаточности (ХПН) [4].

Цель исследования – изучение влияние эритропоэтина на тромбоцитарно-клеточные взаимодействия в крови при хронической почечной недостаточности.

Материал и методы исследования

Первоначально обследовано 160 больных с терминальной стадией ХПН, находящихся на постоянном лечении в отделении диализа ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница». После рандомизации в исследование включено 62 больных, в том числе 32 женщины и 30 мужчин, средний возраст 47,96 ± 1,33 лет. Критерии исключения: декомпенсация со стороны сердечно-сосудистой, дыхательной, пищеварительной систем; наличие в анамнезе туберкулеза, венерических заболеваний, гепатита, ВИЧ-инфекции, онкологической патологии; острые нарушения церебрального кровообращения; наличие острого воспалительного процесса; больные с гематологическими заболеваниями и системными васкулитами; беременность. Все больные ХПН 3 раза в неделю в течение 4 часов получали гемодиализную терапию на аппаратах «Искусственная почка» 4008S/BIBAG фирмы «Fresenius» (Германия). Контрольная группа (группа I, n = 25) представлена клинически здоровыми добровольцами – донорами областной станции переливания крови г. Челябинска, не имеющими соматической патологии и сопоставимыми по возрасту и полу с основными группами. Группа II – больные ХПН, находящиеся на гемодиадизе (n = 24). Группа III – больные ХПН, находящиеся на гемодиадизе и получающие рекомбинантный человеческий ЭПО в составе препарата «Рекормон» (МНН: эпоэтин бэта, «Roche», Швейцария) 2 раза в неделю внутривенно в дозе 2000–4000 МЕ в течение 2 месяцев (n = 38). Суммарная доза введенного ЭПО составила около 50000 МЕ. Кровь для исследований у больных ХПН забирали из артериального колена артерио-венозной фистулы до сеанса гемодиализа.

Тромбоцитарно-лейкоцитарные взаимодействия исследовали на проточном цитофлюориметре «FACS Canto-II» (Becton Dickinson, США) с использованием моноклональных антител, меченных CD41- FITC (Beckman Coulter, США); CD61- FITC (Beckman Coulter, США); CD42b – РЕ (BD Pharmingen, США). Субпопуляции лейкоцитов (лимфоциты, моноциты и нейтрофилы) выделяли по интенсивности экспрессии CD45 и характеристикам светорассеяния. Учитывая, что гликопротеины CD41+, CD42b+, CD61 + присущи только тромбоцитам, свечение их на лейкоцитах свидетельствует о кооперации лейкоцитов с тромбоцитами. Оценка тромбоцитарно-лейкоцитарных коопераций осуществлялась по относительному количеству лимфоцитов, моноцитов, гранулоцитов, взаимодействующих с тромбоцитами. Эритроцитарно-тромбоцитарные взаимодействия исследовали после перемешивания и инкубации суспензии эритроцитов и тромбоцитов с концентрацией 300•109/л и 10•1010/л соответственно: в камере Горяева подсчитывали количество эритроцитарно-тромбоцитарных коагрегатов (ЭТК) в единице объема; коагрегаты дифференцировали на малые (количество эритроцитов и тромбоцитов в розетке не превышает 3 клеток) и большие (количество эритроцитов и тромбоцитов в розетке больше 3) [1, 2, 14]. Количество тромбоцитов определяли на гематологическом анализаторе фирмы «Orphee» (Япония) волюмометрическим методом. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ «Statistica v. 6.0 for Windows». Характеристика выборок представлена в формате «М ± m», где М – среднее арифметическое значение признака, m ? стандартная ошибка среднего. Для анализа вида распределения данных применяли критерий Шапиро-Уилка, для проверки равенства дисперсий в груп-
пах – критерий Левена. Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием критериев Манна-Уитни (U), Вальда-Вольфовитца (WW). Отличия считали статистически значимыми при р < 0,05. Для оценки связи между показателями использовали методы корреляционного анализа с вычислением коэффициента корреляции Спирмена (R).

Результаты исследования и их обсуждение

Установлено, что у больных ХПН адгезия тромбоцитов с нейтрофилами и моноцитами увеличивается, причем в большей степени с моноцитами (прирост 84 %), а не с нейтрофилами (прирост 31 %) (табл. 1). В то же время количество тромбоцитарно-лимфоцитарных коагрегатов снижается в среднем на 27 %. Показателен сам факт тромбоцитарно-лейкоцитарных взаимодействий, учитывая известные агрессивные свойства лейкоцитов, в первую очередь, фагоцитов. Оказывается, что структурное взаимодействие тромбоцитов с нейтрофилами и моноцитами приводит к взаимной активации этих клеток по аутокринному и паракринному механизмам. В частности, у нейтрофилов и моноцитов повышается адгезия, хемотаксис, хемокинез и фагоцитарная активность, у тромбоцитов активируется метаболизм, что отражается увеличением синтеза тромбоксана А2 и других факторов. Тромбоцитарно-моноцитарная коагрегация регулирует участие моноцитов не только в фагоцитарных реакциях, но и в коагуляционном каскаде в связи с экспрессией тканевого фактора, β₂-интегринов и секрецией цитокинов [8]. Механизмы, опосредующие тромбоцитарно-лейкоцитарные взаимодействия, до конца не ясны. Полагают, что взаимодействие тромбоцитов с нейтрофилами определяются Р-селектином на тромбоцитах и L-селектином на лейкоцитах, более прочные связи образуются между ICAM-2 и Gp IIb-IIIa на тромбоцитах и β₂-интегрином на нейтрофилах [9].

Кроме взаимодействия с лейкоцитами, тромбоциты активно вступают в контакт с эритроцитами. В табл. 2 приведены данные о количестве тромбоцитарно-эритроцитарных коагрегатов у больных ХПН. Установлено, что количество тромбоцитарно-эритроцитарных коагрегатов уменьшается за счет малых и больших форм. Возможно, что феномен тромбоцитарно-эритроцитарных взаимодействий в крови может отражать трофическую функцию эритроцитов по отношению к кровяным пластинкам, т.к эритроцитарные мембраны могут выступать в качестве доноров фосфолипидов для тромбоцитов. Показано, что в организме происходит прямой и быстрый обмен между плазменными и тромбоцитарными фосфолипидами с последующим их включением в мембранные липиды. Известно, что эритроциты при ХПН имеют количественные и качественные изменения фосфолипидного состава мембран: за счет активации процессов свободно-радикального окисления снижена подвижность ацильных цепей фосфолипидов и увеличена упорядоченность мембранных липидов и полярность липидного бислоя, повышается содержание фосфатидилсерина на поверхности эритроцита. Важным следствием экстернализации фосфатидилсерина является феномен повышенной адгезивности эритроцитов к сосудистому эндотелию и клеткам крови [6].

Кроме этого, нельзя исключить взаимные регуляторные влияния эритроцитов и тромбоцитов. В литературе есть данные о повышении функциональной активности тромбоцитов, контактирующих с эритроцитами, опосредованной увеличением синтеза тромбоксана А2. Механизмы, обеспечивающие тромбоцитарно-эритроцитарные взаимодействия в крови, точно неизвестны. Полагают, что они могут быть связаны с тромбоцитарными рецепторами GрIIIb (CD36) и Gр Ib, но не с vWF, тромбоспондином, Р-селектином и СD47 [10]. Экспозиция эритроцитов с тромбоцитами оказывает проагрегантный эффект, приводит к высвобождению тромбоцитарных факторов Р₃, Р₄, Р₁₀. Механизмом активации тромбоцитов является усиление процессов перекисного окисления липидов не только в плазме, самих тромбоцитах, но и в эритроцитах [2]. Можно предположить, что формирование тромбоцитарно-эритроцитарных коагрегатов вносит вклад в изменение гемореологии у больных ХПН, аналогично тому, как это установлено в патогенезе инсулинзависимого сахарного диабета и некоторой хирургической патологии.

Изменение кооперации тромбоцитов и эритроцитов у больных ХПН зависит от развития анемии. Ранее нами была зафиксирована нормохромная, нормоцитарная анемия у больных ХПН [3]. Обнаружено, что общее количество тромбоцитарно-эритроцитарных коагрегатов до процедуры гемодиализа уменьшается по мере снижения количества эритроцитов в периферической крови (коэффициент корреляции Спирмена R = 0,65; р < 0,05). В то же время общеизвестно, что эритроцитам принадлежит ключевая роль в формировании гемореологии, особенно на уровне микроциркуляции, что определяется их количеством и поведением в кровотоке.

Установлено значимое влияние ЭПО на кооперацию тромбоцитов с другими клетками крови, лейкоцитами и эритроцитами, у больных ХПН (табл. 1, 2). Так, ЭПО уменьшает количество тромбоцитарно-нейтрофильных и тромбоцитарно-моноцитарных коагрегатов и увеличивает количество тромбоцитарно-лимфоцитарных коагрегатов.

Таблица 1

Влияние эритропоэтина на тромбоцитарно-лейкоцитарные взаимодействия у больных ХПН (M ± m)

Примечание. Здесь и далее р - показатель значимости различий между группами по критерию Манна-Уитни (WW –Вальда-Вольфовитца).

Полагаем, что снижение способности тромбоцитов к взаимодействию с нейтрофилами и моноцитами в определенной мере обусловлено уменьшением представительства Gp IIb-IIIa на поверхности тромбоцитов. В то же время изменение тромбоцитарно-лейкоцитарных взаимодействий может быть связано с влиянием ЭПО не только на тромбоциты, но и на лейкоциты. Показано, что нейтрофилы, моноциты, Т- и В-лимфоциты экспрессируют на своей поверхности рецепторы к ЭПО, что предполагает участие ЭПО в важных внутриклеточных сигнальных путях, опосредующих функциональную активность и жизнеспособность этих клеток. В частности, ЭПО обладает способностью снижать адгезивную способность фагоцитов к эндотелию в патогенезе постишемической дисфункции миокарда [13]. У больных ХПН ЭПО предупреждает чрезмерную активацию фагоцитов в ходе диализной процедуры [12]. Кроме того, известно, что у больных ХПН, получающих гемодиализную терапию, усиливается апоптоз лимфоцитов, в особенности Т-лимфоцитов [7]. ЭПО как антиапоптогенный фактор может подавлять апоптоз и, как следствие, увеличивать количество функционально активных лимфоцитов, способных взаимодействовать с тромбоцитами. Полагают, что такие эффекты ЭПО опосредованы рецептор I опухольнекротизирующего фактора и обеспечиваются внутриклеточной перекрестной сигнализацией через активацию антиапоптического транскрипционного фактора NF-kappaB и JANUS-2/STAT киназы с последующей активацией экспрессии генов bcl-XL и синтеза антиапоптогенных белков [15]. Причем, эффекты ЭПО на экспрессию pSTAT5 в CD4 + лимфоцитах являются дозозависимыми [11].

Применение ЭПО у больных ХПН приводит к повышению, и как следствие, нормализации количества эритроцитарно-тромбоцитарных коагрегатов (табл. 2). Эффекты ЭПО реализуются за счет их влияния на формирование малых коагрегатов.

Таблица 2

Влияние эритропоэтина на тромбоцитарно-эритроцитарные взаимодействия
у больных ХПН (M ± m)

Полученные результаты могут быть связаны с протекторными эффектами ЭПО в отношении эритроцитов в кровотоке. Имеются сведения о прямом антиоксидантном эффекте ЭПО в отношении эритроцитов, который связан с увеличением содержания глутатиона, снижением генерации кислородных радикалов, накоплением гидроперекисей липидов и, как следствие, стабилизацией цитоплазматической мембраны, маркируемой экстернализацией фосфатидилсерина [5]. Кроме этого, нельзя исключить тот факт, что восстановление тромбоцитарно-эритроцитарных взаимодействий, определяемое по количеству коагрегатов, может быть обусловлено увеличением количества тромбоцитов и эритроцитов в крови на фоне применения ЭПО. Обнаружена положительная слабая связь между количеством тромбоцитарно-эритроцитарных коагрегатов и количеством эритроцитов в крови (R = 0,27; р < 0,05).

Выводы

Таким образом, у больных ХПН изменяется кооперация тромбоцитов с другими клетками крови: увеличивается количество тромбоцитарно-нейтрофильных и тромбоцитарно-моноцитарных коагрегатов, уменьшается количество тромбоцитарно-лимфоцитарных и тромбоцитарно-эритроцитарных коагрегатов. ЭПО вмешивается в реализацию тромбоцитарно-клеточных взаимодействий в крови у больных ХПН и приводит к частичной или полной нормализации клеточной кооперации. Механизм действия ЭПО, в том числе, обусловлен увеличением количества эритроцитов в периферической крови.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект 12-04-31726 «Механизм влияния эритропоэтина на функциональную активность тромбоцитов».

Библиографическая ссылка