Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы

Кузнецова И.В., Евстигнеев Д.А., Глухова Н.В., Глухов В.П.

Характер действия экзогенного оксида азота (NO) изучался при помощи метода внеклеточной регистрации электрической активности миелинизированных нервных волокон Rana ridibunda Pallas. NO вызывает сокращение длительности потенциала действия и уменьшение амплитуды и длительности следовой деполяризации. NO уменьшает амплитуду деполяризационного плато и длительность посттетанической деполяризации. Вызываемые 4-аминопиридином поэтапные изменения длительности следовой деполяризации (первоначальное увеличение длительности, прекращение роста длительности и уменьшение длительности с переходом в следовую гиперполяризацию) в присутствии NO развиваются за более короткое время. В присутствии NO 4-аминопиридин приводит к генерации следовой гиперполяризации и посттетаническая гиперполяризации, амплитуда и длительность которых существенно больше, чем амплитуда и длительность данных гиперполяризационных потенциалов, вызываемых 4-аминопиридином в отсутствие NO.

Статья в формате PDF

206 KB

Введение

Способность экзогенного оксида азота (NO) активировать ионные токи установлена для различных возбудимых мембран. Показано, что NO вызывает активацию калиевой проводимости в круговой мышце пищевода опоссума [10], активирует кальций-активируемую калиевую проводимость гладкомышечных клеток кролика [8], активирует регулируемые циклическими нуклеотидами каналы обонятельных клеток саламандры [9], активирует входящий и нечувствительный к потенциалу ток с потенциалом реверсии близком к 0 мВ в каналах (регулируемых циклическими нуклеотидами) колбочек ящериц [12], активирует регулируемые циклическими нуклеотидами каналы слуховых волосковых клеток Кортиевого органа морских свинок [3].

В работе А.Л. Зефирова и др. [2] установлено, что экзогенный оксид азота увеличивает выходящий потенциал-зависимый калиевый ток и угнетает Са²⁺-активируемый калиевый ток мембраны нервного окончания. В последующем информация об активации NO потенциал-зависимого калиевого тока была подтверждена А.Л. Зефировым и др. [1] и А.В. Яковлевым [7]. В той части работы А.Л. Зефирова и др. [1], которая посвящена миелинизированным нервным волокнам, нами показано, что экзогенный оксид азота приводит к укорочению длительности потенциала действия (ПД) и уменьшению амплитуды следовой деполяризации (СД), что было отнесено за счёт увеличения потенциал-зависимых калиевых токов нодальной мембраны. При блокировании калиевых каналов 4-аминопиридином, приводящем к растягиванию ПД и появлению на его нисходящей фазе дополнительных спайков, NO не изменял длительность ПД и амплитуду СД. В цитируемой работе мы остановились на описании эффектов NO только на ПД и начальную часть СД.

Целью настоящей работы явились изучение эффектов NO на длительные следовые потенциалы миелинизированных нервных волокон при раздражении последних одиночными и ритмическими стимулами и интерпретация полученных результатов с позиции наличия в нодальной мембране быстрых и медленных калиевых каналов. Результаты настоящей работы представлены ранее в виде краткого сообщения [6].

Методика

Эксперименты (всего 27) проводили на одиночных миелинизированных нервных волокнах озёрной лягушки Rana ridibunda Pallas. Препаровку нервного волокна проводили таким образом, что изолировали лишь интернодальную часть волокна, а перехват Ранвье, от которого в последующем отводили ПД, оставляли интактным в нервном стволе. Схема расположения нервного волокна в экспериментальной камере приведена ранее [4]. Раздражение нервного волокна производили одиночными (длительностью 0.1 мс) и ритмическими (частотой 10, 50, 100 и 300 Гц) прямоугольными стимулами. Раствор Рингера, использованный в экспериментах, имел следующий состав (в ммоль/л): NaCl - 111; KCl - 2.5; CaCl₂ - 1.95; NaHCO₃ - 1.2. Эксперименты проводили при температуре 17-22^о С. Статистическая обработка экспериментальных данных осуществлялась с использованием критерия Стьюдента. В качестве донора NO использовался нитропруссид натрия в концентрации 20 ммоль/л.

Результаты и их обсуждение

Одиночное раздражение нервного волокна приводит к возникновению ПД, амплитуда и длительность которого составили в среднем 78.01 ± 8.37 мВ и 1.53 ± 0.25 мс соответственно. Амплитуда и длительность СД, развивающейся после ПД и представляющей собой медленное возвращение мембранного потенциала к исходному значению, составили в среднем 2.31 ± 0.83 мВ и 198.88 ± 35.43 мс соответственно.

Добавление к раствору Рингера NO приводит к наблюдаемому во всех экспериментах сокращению (на 10-17%) длительности ПД, а также уменьшению амплитуды (с 2.31 ± 0.83 мВ до 1.15 ± 0.7 мВ) и длительности (с 198.88 ± 35.43 мс до 142.57 ± 26.72 мс) СД. Как известно [11], за фазу реполяризации ответственны быстрые калиевые каналы. В связи с этим укорочение длительности ПД под влиянием NO является свидетельством активации быстрых калиевых каналов.

В следующих сериях экспериментов нами изучена динамика изменений амплитудно-временных характеристик следовых потенциалов в присутствии NO и блокаторов калиевых каналов. Сначала изучено совместное действие NO и блокатора быстрых калиевых каналов 4-аминопиридина (рис. 1). Как оказалось, предварительная обработка нервных волокон NO не препятствует развитию типичных эффектов 4-аминопиридина на ПД и начальную часть СД. Как и в растворе Рингера без NO, в присутствии NO 4-аминопиридин вызывает расширение ПД и увеличение амплитуды СД. Вызываемые же 4-аминопиридином в обычном растворе Рингера поэтапные изменения длительности СД (первоначальное увеличение длительности, прекращение роста длительности и, наконец, уменьшение роста длительности с переходом в следовую гиперполяризацию) в присутствии NO развиваются более стремительно - за более короткое время. В присутствии NO 4-аминопиридин приводит к генерации следовой гиперполяризации (СГ), амплитуда и длительность которой существенно больше, чем амплитуда и длительность СГ, вызываемой 4-аминопиридином в отсутствие NO. На основании того, что вызываемая 4-аминопиридином СГ относится за счёт активации медленного калиевого тока [5], а NO значительно увеличивает эту СГ, можно заключить, что NO является активатором не только быстрых, но и медленных калиевых каналов.

Рис. 1. Совместное действие экзогенного оксида азота (NO) и блокаторов калиевых каналов 4-аминопиридина (4-АП) и тетраэтиламмония на потенциал действия (ПД) и следовую деполяризацию (СД) миелинизированных нервных волокон амфибий. А - ПД (а) и СД (б - г) в нормальном растворе Рингера; Б и В - ПД и СД через 3 (Б) и 6 (В) минут действия NO; Г, Д, Е - то же спустя 6 (Г), 10 (Д), 14 (Е) минут после добавления к раствору Рингера с оксидом азота 4-АП. Ж, З, И - то же через 3 (Ж), 5 (З) и 8 (И) минут после добавления к раствору Рингера, содержащему NO и 4-АП, тетраэтиламмония

Рис. 2. Влияние экзогенного оксида азота (NO) на следовые потенциалы, регистрируемые при ритмической стимуляции нервного волокна. Опыт № 610 (начало). А - следовые потенциалы в нормальном растворе Рингера при ритмической стимуляции нервного волокна частотой 10 (1, а - б), 50 (2, а - б), 100 (3, а - б) и 300 (4, а - б) Гц при разном (а и б) усилении; Б - то же через 6 минут действия NO

Таким образом, в присутствии блокатора быстрых калиевых каналов 4-аминопиридина NO уже не может активировать быстрые каналы и воздействует на незаблокированные медленные каналы, приводя к усилению медленного калиевого тока и, как следствие, генерации большей по амплитуде и длительности СГ. Интересно, что блокатор быстрых и медленных калиевых каналов тетраэтиламмоний не препятствует дальнейшему росту амплитуды и длительности следовой гиперполяризации, вызываемой совместным действием 4-аминопиридина и NO. Анализу данного факта будет посвящена отдельная работа.

В процессе ритмического раздражения нервных волокон происходит постепенное увеличение амплитуды СД - происходит её суммация. При частотах раздражения 50, 100 и 300 Гц во время ритмического раздражения формируется деполяризационное плато (начало деполяризационного плато соответствует моменту прекращения прироста амплитуды СД в ритмическом ряду). В опыте, представленном на рис. 2, амплитуда деполяризационного плато при частотах раздражения 50, 100 и 300 Гц составила 2.73, 4.4, 8.59 мВ соответственно. Среднее значение амплитуды деполяризационного плато составило по данным 8 экспериментов 3.87 ± 1.17 мВ, 5.32 ± 0.98 мВ, 8.24 ± 1.13 мВ при частотах раздражения 50, 100 и 300 Гц соответственно. После прекращения ритмического раздражения развивается посттетаническая деполяризация (ПТД). Нередко после ПТД следует противоположный по своему знаку потенциал - посттетаническая гиперполяризация (ПТГ). В опыте, представленном на рис. 2, ПТГ в нормальном растворе Рингера не возникла (данный следовой потенциал, как правило, возникает при частоте раздражения 300 и реже - 100 Гц).

Добавление к нормальному раствору Рингера NO приводит как к уменьшению следовых потенциалов во время ритмического раздражения (уменьшается амплитуда деполяризационного плато), так и после прекращения ритмического раздражения (уменьшается амплитуда и длительность ПТД). В опыте, представленном на рис. 2 Б, значения амплитуды деполяризационного плато под влиянием NO составили 1.18, 2.59, 5.41 мВ при частотах стимуляции 50, 100 и 300 Гц соответственно. Амплитуда деполяризационного плато достоверно (Р < 0.01) уменьшилась при всех (50, 100 и 300 Гц) используемых частотах раздражения в среднем до 1.34 ± 0.49, 1.82 ± 0.60, 4.37 ± 1.79 мВ соответственно. В опыте на рис. 2 длительность ПТД под влиянием NO уменьшилась в 3.1, 4.3 и 7.3 раза при раздражении нервного волокна частотой 50, 100 и 300 Гц соответственно. Тенденция к большему сокращению длительности ПТД по мере увеличения частоты стимуляции наблюдалась во всех экспериментах.

В следующей серии опытов исследовано поведение следовых потенциалов при ритмическом раздражении в условиях совместного действия NO и блокаторов калиевых каналов. Исходя из того, что происходящие под влиянием 4-аминопиридина уменьшение длительности ПТД, появление ПТГ при низкочастотной стимуляции и её усиление при высокочастотной стимуляции были отнесены за счёт активации медленных калиевых каналов [5], а NO способен в присутствии 4-аминопиридина активировать медленные калиевые каналы, следует ожидать, что эффекты 4-аминопиридина на медленные калиевые каналы при ритмическом раздражении будут усиливаться NO. Действительно, амплитуда и длительность ПТГ, получаемой при совместном действии 4-аминопиридина и NO (рис. 3), значительно превосходят амплитуду и длительность ПТГ, вызываемой применением только одного 4-аминопиридина. На рис. 4 представлены осциллограммы продолжения опыта, представленного на рис. 2 и 3. Осциллограммы иллюстрируют временной ход следовых потенциалов при ритмическом раздражении нервных волокон после добавления к раствору Рингера, содержащему NO и 4-аминопиридин, тетраэтиламмония в концентрации 10 ммоль/л. Как можно заметить, тетраэтиламмоний, как и в случае следовых потенциалов при одиночном раздражении, не препятствует эффектам, развиваемым 4-аминопиридином.

Данные, полученные в настоящей работе, согласуются с представлениями о возможности активации ионных каналов под влиянием NO и дополняют перечень возбудимых мембран, ионные каналы которых чувствительны к NO. Настоящая работа является продолжением изучения вклада быстрых и медленных калиевых каналов в механизм электрической активности мембраны миелинизированных нервных волокон амфибий [4, 5]. Важным оказалось то, что, активируя быстрые калиевые каналы, NO может также активировать медленные калиевые каналы, если быстрые оказываются заблокированными. Блокатор быстрых калиевых каналов 4-аминопиридин, как показано в нашей предыдущей работе [5], вызывает поэтапные изменения длительности СД миелинизированных нервных волокон амфибий: первоначальное увеличение длительности, прекращение роста длительности и, наконец, уменьшение роста длительности СД с переходом в следовую гиперполяризацию. Эти расставленные во времени фазные изменения длительности СД были отнесены за счёт постепенного нарастания (по мере увеличения доли заблокированных быстрых калиевых каналов) медленного калиевого тока. В частности, та СГ, которая возникала под действием 4-аминопиридина, также отнесена за счёт активации медленных калиевых каналов: её величина была тем больше, чем больше по своей площади был вызванный 4-аминопиридином многоспайковый ответ, то есть чем более деполяризованной была мембрана [5]. Как установлено в настоящей работе, СГ, вызванная 4-аминопиридином и NO, по своей величине существенно больше таковой при применении только одного 4-аминопиридина, что является свидетельством в пользу активации NO медленных калиевых каналов.

Рис. 3. Следовые потенциалы при ритмической стимуляции нервного волокна в присутствии оксида азота (NO) и 4-аминопиридина (4-АП). Опыт № 610 (продолжение). А - следовые потенциалы при ритмической стимуляции нервного волокна частотой 10 (1, а - б), 50 (2, а - б), 100 (3, а - б) и 300 (4, а - б) Гц после 6 минутного действия 4-АП в растворе Рингера, содержащем NO. Б - то же после 10 минут действия 4-АП на фоне NO

Рис. 4. Следовые потенциалы при ритмической стимуляции нервного волокна в присутствии оксида азота (NO), 4-аминопиридина (4-АП) и тетраэтиламмония. Опыт № 610 (продолжение). А - следовые потенциалы при ритмической стимуляции нервного волокна частотой 10 (1, а - б), 50 (2, а - б), 100 (3, а - б) и 300 (4, а - б) Гц после 2 минутного действия ТЭА в растворе Рингера, содержащем NO и 4-АП. Б - то же после 4 минут действия ТЭА на фоне NO и 4-АП

Выводы

1. NO приводит к сокращению длительности СД, а также уменьшению получаемого во время ритмической стимуляции деполяризационного плато и регистрируемой после окончания ритмической стимуляции ПТД.
2. В присутствии NO 4-аминопиридин вызывает расширение ПД и увеличение амплитуды СД - подобно тому, как это происходит под действием только одного 4-аминопиридина.
3. Вызываемые 4-аминопиридином поэтапные изменения длительности СД (первоначальное увеличение длительности, прекращение роста длительности и уменьшение длительности СД с переходом в СГ) в присутствии NO развиваются за более короткое время. В присутствии NO 4-аминопиридин приводит к генерации СГ, амплитуда и длительность которой существенно больше, чем амплитуда и длительность СГ, вызываемой 4-аминопиридином в отсутствие NO.
4. В присутствии блокатора быстрых калиевых каналов 4-аминопиридина NO уже не может активировать быстрые каналы и воздействует на незаблокированные медленные каналы, приводя к усилению медленного калиевого тока и, как следствие, генерации большей по амплитуде и длительности следовой гиперполяризации.
5. Совместное действие NO и 4-аминопиридина вызывает возникновение ПТГ большей амплитуды и длительности, чем ПТГ в присутствии только одного 4-аминопиридина.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Зефиров А.Л., Каталымов Л.Л., Усмендеева (Кузнецова) И.В., Халиуллина Р.Р. // Бюл. экспер. биол. - 2001. - Т. 131. - № 5. С. 604.
2. Зефиров А.Л., Халиуллина Р.Р., Анучин А.А. // Бюл. экспер. биол. - 1999. - Т. 128. - № 8. С. 144.
3. Каламкаров Г.Р., Кулагина О.Г. // Сенсорные системы. - 1999. - Т. 13. - № 3. С. 226.
4. Кузнецова И.В., Евстигнеев Д.А., Глухова Н.В. // Фiзiологiчний журнал (Киïв). - 2005. - Т. 51. - № 2. С. 96.      
5. Кузнецова И.В., Евстигнеев Д.А., Глухова Н.В. // Фiзiологiчний журнал (Киïв). - 2007. - Т. 53. - № 3. С. 61.
6. Кузнецова И.В., Евстигнеев Д.А., Глухова Н.В. // Фундаментальные исследования. - 2007. - № 8. С. 57.
7. Яковлев А.В. Роль циклических нуклеотидов в реализации эффектов оксида азота (II) на секрецию медиатора и ионные токи двигательного нервного окончания. Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. - Казань, 2004. - 17 с.
8. Bolotina V.M., Najibi S., Palacino J.J., Pagano P.J., Cohen R.A. // Nature. - 1994. - Vol. 368. P. 850.
9. Broillet M.C., Firestein S. // Neuron. - 1996. - Vol. 16. - № 2. P. 377.
10. Cayabyab F.S., Daniel E.E. // Am. J. Physiol. - 1995. - Vol. 268. P. 831.
11. Poulter M.P., Padjen A.L. // Neuroscience. - 1995. - Vol. 68. - № 2. P. 497.
12. Savchenko A., Barnes S., Kramer R.H. // Nature. - 1997. - Vol. 390. P. 694.

Библиографическая ссылка