Острый гломерулонефрит - тяжелое поражение структуры почечных клубочков, развивающееся вследствие перенесенной стрептококковой инфекции, вызванной в основном, штаммами М серотипов 1, 2, 4, 12, 18, 25, 49, 55, 57, 60 и некоторых других М-типов стрептококка группы А. Общепринятым является мнение об остроте процесса, однако заболевание может иметь хроническое течение, нередко приводить к дисфункции почек (альбуминурия и снижение скорости клубочковой фильтрации могут сохраняться у перенесших острый гломерулонефрит пожизненно), что позволяет рассматривать его в ряду причинных факторов хронической болезни почек [4]. В настоящее время диагноз острый постстрептококковый гломерулонефрит реже ставится в специализированных нефрологических отделениях, хотя по-прежнему наблюдаются и спорадические случаи, и эпидемические вспышки данного заболевания [2,6,7].
Накопленный клинический и экспериментальный опыт позволяет проследить основные моменты в патогенезе заболевания, которые сводятся к активности «нефритогенных» продуктов, нарастанию титров антител к ряду экстрацеллюлярных продуктов и энзимов стрептококка, снижению уровня комплемента, дисбалансу содержания иммуноглобулинов и повреждающему действию циркулирующих специфических иммунных комплексов [3,5]. Существенный вклад в патогенетическое обоснование острого постстрептококкового повреждения гломерулярных структур внесли работы по созданию экспериментальных моделей на мышах и кроликах. При использовании мышей в качестве экспериментальных животных воспроизведение заболевания осуществлялось посредством инокуляции живой культуры стрептококка и создания локального очага инфекции, откуда экстрацеллюлярные продукты распределялись по организму хозяина. В модели на кроликах использовалась многократно вводимая парентерально и убитая прогреванием культура Streptococcus pyogenes, сохранившая поверхностно локализованные факторы патогенности микроба и подвергающаяся генерализации в его организме [1].
Создание экспериментальных моделей острого гломерулонефрита необходимо не только для дальнейшего изучения механизмов пато- и морфогенеза заболевания, но и для доклинической апробации новых лекарственных препаратов, предлагаемых фармацевтической промышленностью и обладающих нефропротективным действием.
Материалы и методы исследования:
Эксперимент выполнен на 26 животных - самцах и самках беспородных белых крыс четырехмесячного возраста, содержащихся в стандартных условиях вивария. Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г.
Животные были разделены на 2 экспериментальные группы: I группа - контрольная (интактные животные), n=10; II группа (опытная) - животные, иммунизированные бактериальной суспензией эталонного штамма Streptococcus pyogenes (ГНИИ стандартизации и контроля им. Л. А. Тарасевича), n=16. С целью подтверждения воспроизводимости эксперимента II группа была подразделена на 2 подгруппы, различающиеся сроком забора мочи для лабораторного исследования и органов для аутопсии и гистологического анализа (21 и 31 день иммунизации).
Антигенную суспензию для иммунизации животных получали путем культивирования штамма на мясопептонном бульоне в аэробных условиях при температуре +370С, последующем центрифугировании суточной бульонной культуры Streptococcus pyogenes в течение 10-15 минут при скорости 3000 оборотов в минуту и последующем удаления супернатанта. Полученную взвесь концентрацией 109 КОЕ / мл, определяемой на КФК-3 (оптическая плотность 0,028, длина волны 540 нм, кювета - 1,060 мм), инактивировали при +56 ºС в течение 30 минут. Из расчета 50 мкл взвеси на 1 животное готовили разведение: 9 мл стерильного физиологического раствора и 1 мл взвеси (на 1 животное приходится 500 мкл (0,5 мл) полученной вновь взвеси антигенной суспензии). Иммунизацию животных проводили внутрибрюшинно 1 раз в день по схеме: 3 цикла, каждый из которых состоял из 1, 3, 5 дней иммунизации и 2 дней перерыва между циклами.
Перед началом эксперимента у животных контрольной (интактной) и опытной группы проводили микроскопию мочевого осадка и анализ разовой порции мочи на белок, используя качественную реакцию с 20 %-ной сульфосалициловой кислотой. В конце каждого цикла иммунизации у животных контрольной и опытной групп также исследовали разовую порцию мочи на белок и проводили микроскопию осадка. По окончании опыта животных выводили из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Внутренние органы забирали для проведения аутопсии и гистологического исследования, почки животных фиксировали в 10 %-ной нейтральном формалине, подвергали обезвоживанию в спиртах возрастающей крепости, заливали в парафин. Срезы получали на ротационном микротоме (толщина 3-4 мкм), окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизону, нитратом серебра по Футу. Микроскопию препаратов в проходящем свете проводили с использованием светового микроскопа Micros (Австрия) при увеличении микроскопа ×60, ×150, ×600, ×1500; захват гистологических объектов осуществляли при помощи цифровой камеры для микроскопа CAM V200 Micros «Handelsgesellschaft m. b. H.» (Австрия).
Результаты исследования
У животных контрольной группы не было выявлено лабораторных и гистологических признаков развития острого гломерулонефрита. В течение всего эксперимента в моче животных этой группы белок не выявлялся, в микроскопии мочевого осадка патологии не обнаружено.
При проведении аутопсии почки животных контрольной группы имели бобовидную форму, капсула легко снималась, обнажая блестящую, гладкую поверхность светло-коричневого цвета. На разрезе корковое вещество почек было светло-коричневого цвета, мозговое вещество - темно-красное. Лоханка не расширена, ее слизистая оболочка блестящая, гладкая. При проведении гистологического исследования строение ткани почек соответствовало нормальному: четко выявлялась капсула, корковое вещество с почечными тельцами и извитыми канальцами, мозговое вещество, визуализировались сосочки и почечная лоханка, выстланная переходным эпителием. Сосудистые клубочки нефрона не изменены. Проксимальные и дистальные почечные канальцы с типичной структурой.
У иммунизированных животных II группы к 21 дню иммунизации визуально отмечалось снижение аппетита и двигательной активности. У 90 % животных при проведении микроскопии мочевого осадка выявили гематурию - от незначительной до средней степени выраженности, исследование мочи на содержание белка показало положительный результат у 80 % животных.
На секции отмечались макроскопические признаки застойной сердечной недостаточности: общее венозное полнокровие; увеличение печени (печень плотная, тёмная); инъецированность сосудов брыжейки, имелись небольшие кровоизлияния.
С целью подтверждения воспроизводимости модели острого гломерулонефрита забор материала у 8 животных II группы осуществляли на 21 день эксперимента. При проведении аутопсии почки иммунизированных животных имели бобовидную форму, были увеличены в размерах, выглядели набухшими. На разрезе корковое вещество имело серовато-коричневый цвет, мозговое вещество - вишнево-красный; лоханка не изменена. При проведении микроскопии гистологических препаратов в ткани почек выявлялось полнокровие сосудов коркового и мозгового вещества, в корковом веществе визуализировалось большое количество увеличенных гиперцеллюлярных клубочков с резко уменьшенным мочевым пространством, инфильтрированных нейтрофильными гранулоцитами, эозинофилами и лимфоцитами, с аккумуляцией большого числа моноцитов в просветах капилляров. Выявленные изменения характеризовали в этом сроке экссудативную фазу воспаления и были выражены не менее чем в 60 % клубочков, выявляемых в гистологическом срезе. Отмечалось сужение просветов капилляров клубочков вследствие пролиферации эндотелиальных и мезангиальных клеток, появление клубочков с лобулярной структурой. В проксимальных и дистальных канальцах нефронов изменения канальцевого эпителия были выражены умеренно (выявлялись участки белковой дистрофии эпителия, в интерстициальной ткани почек - участки воспалительной инфильтрации лимфоцитами, нейтрофилами и макрофагами) и имели очаговый характер.
У всех животных II группы к 31 дню иммунизации при свободном доступе к пище и воде отмечалось значительное снижение аппетита и потребности в жидкости, а также резкое снижение суточного диуреза по сравнению с контрольной группой. При проведении микроскопии мочевого осадка выявляли гематурию средней степени выраженности, содержание белка показало положительный результат у 100 % животных.
При проведении аутопсии у 8 иммунизированных животных II группы на 31 день эксперимента макроскопически имелись признаки отёка почечной ткани, изменения в лоханках отсутствовали. Гистологическое исследование ткани почек животных этой группы выявило в большинстве клубочков (80 %) преобладание процессов пролиферации, что выражалось в появлении, наряду с мезангиальной и эндотелиальной пролиферацией, отложений нитей фибрина и белковых масс в капсуле Шумлянского-Боумена, сращении капилляров клубочка с капсулой и образовании полулуний в отдельных клубочках. Отмечался также тромбоз капилляров почечных телец. Гломерулярная базальная мембрана визуально выглядела значительно утолщенной. В проксимальных и дистальных извитых канальцах находили белковую дистрофию эпителия, в межуточной ткани почек - воспалительную инфильтрацию нейтрофильными гранулоцитами и лимфоцитами.
Таким образом, в гистологических препаратах почек иммунизированных животных наблюдалась морфологическая картина, соответствующая патоморфологическим изменениям, характерным для
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Бурова Л. А. Способность стрептококков группы А типа М12 связывать иммунные комплексы и их роль в патогенезе постстрептококкового гломерулонефрита / Л. А. Бурова, Е. А. Гаврилова. П. В. Пигаревский, В. Г. Селиверстова, В. А. Нагорнев, К. Шален, Артем А. Тотолян // Медицинская иммунология. - 2006. - Т. 8, № 5-6. - С. 623-630.
- Acute post-streptococcal glomerulonephritis in children of French Polynesia: a 3-year retrospective study / O. Becquet, J. Pasche, H. Gatti, C. Chenel, M. Abély, P. Morville, C. Pietrement// Pediatr. Nephrol. - 2010. - Vol. 25, № 2. - P. 275-280.
- Cunningham, M. W. Pathogenesis of group A streptococcal infections / M. W. Cunningham// Clin. Microbiol. Rev. - 2000. - Vol. 13. - P. 470-511.
- Acute postinfectious crescentic glomerulonephritis: clinicopathologic presentation and risk factors / A. A. El-Husseini, H. A. Sheashaa, A. A. Sabry, F. E. Moustafa, M. A. Sobh // Int. Urol. Nephrol. - 2005. Vol. 37, № 3. - P. 603-609.
- Garnier, A, Postinfectious acute glomerulonephritis / A. Garnier, M. Peuchmaur, G. Deschênes // Nephrol Ther. - 2009. Vol. 5, № 2. - P. 97-101.
- Jankauskiene, A. Postinfectious glomerulonephritis in children in Lithuania during 1995-2004: prevalence and clinical features / A. Jankauskiene, B. Pundziene, R. Vitkevic // Medicina (Kaunas). - 2007. Vol. 43, № l. - P. 16-22.
- Wong, W. Outcome of severe acute post-streptococcal glomerulonephritis in New Zealand children / W. Wong, M. C. Morris, J. Zwi // Pediatr. Nephrol. - 2009. Vol. 24, № 5. - P. 1021-26.