Введение.
В Саратовской области с 1986 г. зарегистрирован стойкий природный очаг геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) с высокой заболеваемостью и периодически возникающими вспышками. Последняя вспышка данного заболевания отмечена в 1999 г., когда число больных составило 618 человек (заболеваемость - 22,70/000). В начале 21 века уровень заболеваемости колеблется в пределах 3,990/0000 (2003г.) - 5,260/0000 (2004 г.) Особенности формирования иммунного ответа при ГЛПС до настоящего времени изучены недостаточно, что особенно важно при проведении организационных лечебно-профилактических и противоэпидемических мероприятий.
В настоящей работе была поставлена задача изучить клинико-иммунологические особенности ГЛПС в различные периоды болезни, а также сравнить показатели суммарных специфических антител к вирусу ГЛПС в сыворотках крови больных людей в зависимости от степени тяжести заболевания.
Материалы и методы исследования.
Для реализации поставленной цели обследовано 53 больных в возрасте от 18 до 64 лет. Мужчин было 39 человек (74%), женщин - 14 (26%). Тяжёлое течение болезни отмечалось у 24 пациентов (45%), среднетяжёлое - у 23 (43%) и лёгкое - у 6 больных (11%). Диагноз устанавливался в соответствии с общепринятыми критериями [2], в динамике оценивались основные клинические и лабораторно-инструментальные данные. Изучение показателей гуморального иммунитета проводилось в различные периоды болезни: олигоанурический, полиурический, ранней реконвалесценции. Контрольную группу, в которой исследовались показатели специфического иммунитета, составили 30 здоровых молодых людей, не болевших ранее ГЛПС, из благополучных по заболеваемости ГЛПС районов области.
Анализ сыворотки крови больных на наличие специфических IgM и IgG к вирусу ГЛПС проводили в непрямом варианте ИФА с использованием компонентов диагностических тест-систем "Хантогност". После выполнения основных этапов, включающих сенсибилизацию, блокировку и специфическую сорбцию вирусных антигенов, в лунки планшетов добавляли исследуемые сыворотки больных в разведениях от 1:10 до 1:160 с последующей 2-х часовой инкубацией в термостате. При оценке этого материала на наличие специфических противовирусных IgM в систему вносили антитела против IgM человека, меченые пероксидазой хрена. При анализе сывороток на противовирусные IgG в лунки добавляли пероксидазный конъюгат против IgG (антител человека). Пробу считали положительной, если значение её оптической плотности было в 2,1 раза большим, чем значение оптической плотности отрицательного контроля. Статистическая обработка материала осуществлялась методом сравнения средних геометрических титров (СГТ) [1].
Суммарные специфические антитела к вирусу ГЛПС определялись непрямым методом иммунофлюоресценции с использованием в качестве диагностикума высушенных, инактивированных и фиксированных ацетоном суспензий смеси клеток VERO - Е6 содержащих антигены 1 - ого (Хантаан), 2 - ого (Пуумала) и 3 - его (Сеул) серотипов вируса ГЛПС. Для контроля специфичности и активности антигенных препаратов применялись анти-ГЛПС иммунные сыворотки 1-го и 2-го серотипов и нормальная сыворотка человека, а также люминесцентная сыворотка против глобулинов человека с голубым эвансом. Учет результатов производился с помощью люминесцентного микроскопа по яркому изумрудно-зеленому свечению цитоплазмы клеток, содержащих антиген вируса ГЛПС. Титром сыворотки считалось ее наивысшее разведение, способное выявлять антиген вируса ГЛПС. Результаты титрования исследуемых сывороток учитывались только в тех случаях, когда наблюдали флуоресцирующее свечение в препаратах при внесении анти-ГЛПС контрольных сывороток 1-го и 2-го серотипов и отсутствие свечения при внесении нормальной человеческой сыворотки.
Для статистической обработки титров антител, дробные значения разведений масштабировались путем умножения каждого показателя на 1024 (максимальное разведение). Статистический анализ полученных результатов производился с использованием пакета программ SPSS. При сравнении суммарных специфических антител в зависимости от тяжести заболевания применялись критерии Манна - Уитни (U) и Колмогорова - Смирнова (K-S,DN). Критерий Манна-Уитни применялся при сравнении двух выборок с неизвестным распределением признака, при неодинаковом количестве вариант. Критерий Колмогорова-Смирнова, который использовался для сравнения двух выборок с неизвестными характеристиками распределения. Достоверными считались результаты, где коэффициент сравнения (р) меньше 0,05.
Результаты исследования и обсуждения.
При оценки клинической картины у наших пациентов установлено, что олигоанурический период длился от 3 до 16 дней и характеризовался лихорадкой у всех больных (100%), головной болью - у 48 больных (90,6%), тошнотой - у 45 (84,9%) рвотой - у 18 (34%), инъекцией сосудов склер - у 48 (90,6%), снижением остроты - у 25 (47,2%), наличием геморрагического синдрома в виде кровоизлияний в склеры - у 23 (43,4%), петехиальной сыпи - у 14 (26,4%), и подкожных кровоизлияний - у 14 больных (26,4%). У 50 больных (94,3%) отмечались боли в поясничной области, у 40 (75,5%) - олигоанурия, у 9 (17%) - анурия. В общем анализе мочи выявлялись снижение относительной плотности у 23 человек (43,4%), протеинурия - у 53 (100%), гематурия - у 53 (100%), наличие гиалиновых цилиндров - у 22 (41,5%), зернистых у - 7 (13,2%), фибринных - у 5 (9,4%); в 49 случаях (92,5%) случаях отмечалась лейкоцитурия. Биохимические изменения со стороны крови характеризовались повышением мочевины, креатинина у всех больных (100%). В общем анализе крови наиболее часто регистрировалась лейкопения у 30 больных (56,7%), нормоцитоз - у 17 (32,1%), умеренный лейкоцитоз - у 6 больных (11,3%).
Длительность полиурического периода составляла от 3 до 6 недель. Самочувствие больных на этом этапе болезни, как правило, улучшалось. Однако часто отмечались тахикардия - в 42 случаях (79,2%), лабильный пульс у 27 больных (50,9%), увеличение количества выделяемой мочи по сравнению с принятой жидкостью у 50 больных (94,3%). Геморрагические проявления исчезали у 12 больных (22,7%), уменьшались боли в поясничной области у 24 больных (45,3%). В анализах мочи отмечались положительные сдвиги. Имела место изогипостенурия у всех больных (100%), лейкоцитурия - у 27 (50,9%), протеинурия - у 46 больных (86, 8%). Цифры мочевины и креатинина оставались повышенными в 49 случаях (92,5%). В общем анализе крови отмечался лейкоцитоз - у 27 человек (50,9%), нормоцитоз - у 17 (32%), лейкопения - у 9 (17%), повышенная СОЭ - у 18 больных (34%).
В периоде ранней реконвалесценции диурез восстанавливался, нормализовались биохимические показатели. Вместе с тем, у большинства больных (90,6%) сохранялись изогипостенурия, у 27 больных (50,9%) отмечалась лейкоцитурия. При ультразвуковом исследовании почек определялись диффузные изменения в паренхиме в 25 случаях (47,2%), расширение в чашечно-лоханочной системе - в 15 случаях (28,3%).
При анализе показателей гуморального иммунитета в олигоанурическом периоде СГТ противовирусных IgM находился в пределах l/40-l/80, в полиурическом периоде отмечалось снижение СГТ IgM (l/20-l/40) и в периоде ранней реконвалесценции СГТ составил 1/10-l/20. Динамика показателей специфических IgG была обратной: в олигоанурическом периоде отмечался минимальный титр - l/4-l/40, в полиурическом периоде СГТ повышался (l/10-l/20), а максимальное его значение регистрировалось в периоде ранней реконвалесценции - l/40-1/80. Таким образом, максимальные значения специфических IgM регистрировались олигоанурическом периоде, а IgG в ранней реконвалесценции.
Титры суммарных специфических антител находились в обратной зависимости от тяжести заболевания, а достоверные отличия исследуемых показателей зарегистрированы в олигоанурическом периоде при сравнении легкой и тяжелой степеней болезни (К-S-DN, р=0,039), а также среднетяжелой и тяжелой (К-S-DN, р=0,0009), в полиурическом периоде - при сравнении среднетяжелой и тяжелой степеней заболевания ( K-S-DN, р=0,0004). Относительно сниженный антителогенез у пациентов с тяжелыми формами ГЛПС, по всей видимости, был обусловлен развивающейся острой почечной недостаточности и выраженными токсико-метаболическими нарушениями в организме.
При оценке суммарного титра специфических антител в различные периоды болезни при сопоставимых по тяжести формах получены следующие результаты: при всех формах ГЛПС более высокие титры обнаруживались в олигоанурическом периоде по сравнению с периодом полиурии, однако достоверные отличия были получены только при среднетяжелой (U, р=0.001 и К -S-DN, р=0,00001) и тяжелой (U, р=0.003 и К -S-DN, р=0,001) формах. Выявленные закономерности можно связать разнонаправленным характером динамики титров антител класса IgM и IgG.
Таким образом, динамика показателей специфических IgM и IgG у больных ГЛПС с тяжелым течением болезни, а также специфических суммарных антител в различные периоды болезни в зависимости от ее тяжести сохраняют закономерности реакций гуморального иммунитета на инфекционный агент. Полученные результаты облегчают проведение клинико - иммунологических параллелей у больных с ГЛПС.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней у животных. - М.: "Агропромиздат", 1986.
- Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Л. Лекции по инфекционным болезням. - М., - т. 2., 2-е издание, 1999.