Ингибин - относится к цитокинам, его молекулярная масса составляет 32 кDa. У мужчин физиологически значимым является ингибин-В. Ингибин-B состоит из α- и β-В-cубъединиц, связанных дисульфидными мостиками.
Ингибин селективно ингибирует освобождение ФСГ из передней доли гипофиза и обладает паракринным действием в гонадах. Концентрация ингибина-В у мужчин обратно пропорционально коррелирует с концентрацией ФСГ, являясь отрицательным эндокринным модулятором ФСГ.
Клиническими исследованиями установлено, что ингибин-В - более ценный маркер гаметогенеза по сравнению с гипофизарным ФСГ поскольку он является прямым маркёром гаметогенеза. Уровень ингибина-В непосредственно отражает функциональное состояние тестикул у мужчин, соответственно, сниженные уровни ингибина-В показывают снижение функции гонад.
Целью нашей работы стало выделение и иммунохимическая идентификация спермоплазменного ингибина-В.
Зная, что ингибин-В имеет сравнительно небольшую молекулярную массу, и его электрофоретическая подвижность лежит в области преальбуминов, мы предприняли попытку выделения этого белка из спермоплазмы сочетанием хроматографических и электрофоретических методов.
Для первичной очисти препарата спермоплазмы от низкомолекулярных балластных фракций была использована гельпроникающая хроматография на сефадексе G-75. Для выделения ингибина-В препарат спермоплазмы подвергали гельпроникающей хроматографии на сефадексе G-75 на колонке 2´90 см, оставляя фракции соответствующие молекулярной массе от 40 до 20 кДа, после диализа провели лиофилизацию полученных фракций. Циклы гельпроникающей хроматографии на сефадексе G-75 повторяли многократно до накопления 500 мг препарата белка.
Дальнейшую очистку проводили методом ионообменной хроматографии на колонке 2,5´85 см с анионообменником ДЕАЕ-тойоперл. Для идентификации полученных фракций использовали диск-электрофорез в ПААГ.
Полученный после лиофилизации препарат белка использовали для иммунизации кролика. Первый цикл иммунизации проводили внутримышечными инъекциями (8 инъекций через 1 день с возрастающей концентрацией белка), реиммунизацию проводили субконъюнктивальными инъекциями (4 инъекций по 2 подряд, затем 3 дня перерыв и еще 2 инъекции). После 3 циклов реиммунизации у кролика брали кровь для получения гипериммунной антисыворотки.
Для получения моноспецифической антисыворотки абсорбцию лиофильно высушенной плазмой крови человека и иммуносорбентами, приготовленными полимеризацией глутаровым альдегидом сыворотки крови и экстрактов органов (почка, печень, селезенка, сердце, легкое, мозг). Гетерологические антитела абсорбировали, смешивая с равным объемом геля и инкубируя при 37°С в течении 2 часов. После центрифугирования полноту истощения контролировали в реакции иммунодиффузии. Полученную таким образом моноспецифическую антисыворотку использовали для конструирования тест-системы.
Для контроля специфичности полученной тест-системы использовали коммерческий препарат ингибина-В (фирма «DSL»), который в иммуноэлектрофорезе и двойной встречной иммунодиффузии показал полную идентичность полученному нами белку.