Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,674

Personal portfolio

Дудко А. А., Трофимов В. А.
Одним из наиболее значимых факторов, приво­дящих к повреждению ядерного генома являются свободные радикалы. Наличие в ядре ненасыщенных липидов определяет их потенциальную роль как ис­точников свободных радикалов, образующихся в про­цессах перекисного окисления липидов [4]. В свою очередь, изменение физико-химических свойств ли­пидного компонента хроматина, обусловленное уси­лением пероксидации липидов, может играть регуля­торную роль в изменении активности генетических процессов. В данной работе представлены данные об изменении окисленности липидов хроматина, разли­чающегося прочностью прикрепления к ядерному матриксу и транскрипционной активностью, в дина­мике регенерационного процесса в печени мышей.

В опыте использовались белые беспородные мыши весом 20-30 г. При частичной гепатэктомии удаляли левую наружную и левую внутреннюю доли печени (2/3 части). Мышей забивали декапитацией. Ядра выделяли из гомогената печени, ресуспендиро­ванного в 0,05 М трис-НСl буфере (рН 9,0), содержа­щем 0,25 М сахарозы, 5 мМ СаСI2 и 20 мМ NH4CI [1]. Чистоту ядерной фракции контролировали при по­мощи световой микроскопии. Высокорастворимую фракцию хроматина (Хр-1) получали экстракцией буфером ТМ (10 мМ Tris-HCI (рН 7,5), с 0,2 мМ MgCl2) при 4оС. После повторной экстракции полу­чали вторую фракцию растворимого хроматина (Хр-2). Затем из остатков ядер экстрагировали хроматин в ТМ-буфере, содержащем 2 М NaCl, и получали высо­косолевую фракцию хроматина (Хр-ВС). После от­мывания ядерного остатка в ТМ-буфере, содержащем 1 %-ный тритон Х-100, получали конечную фракцию хроматина, связанного с ядерным матриксом (Хр-ЯМ). Липиды из изолированных фракций хроматина экстрагировали смесью хлороформ-метанол (1:2, по объему) [3]. Окисленность липидов регистрировали спектрофотометрическим методом и оценивали по величинам индексов окисленности А232/А215 и А275/А215. Малоновый диальдегид (МДА) определяли с помощью ТБК-теста. Концентрацию белка опреде­ляли методом Бредфорд, ДНК с реактивом Дише, РНК орциновым методом [2]. Полученные данные обрабатывали методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента.

Биохимический анализ нуклеиновых кислот и белка показал, что в регенерирующей печени мышей пик транскрипционной активности приходится на 3 час, а репликативной активности на 21,5 час после гепатэктомии.

В липидах хроматина в динамике процесса реге­нерации печени содержание начальных продуктов пероксидации, определяемое по величинам индексов окисленности липидов А232/А215 (диеновые конью­гаты) и А275/А215 (триеновые коньюгаты), макси­мально возрастало во фракции растворимого хрома­тина во время пика транскрипционной активности (рис. 1; 2). В липидах, входящих в состав высокорас­творимого хроматина, напротив, отмечено уменьше­ние окисленности липидов как во время транскрипци­онной, так и репликативной активностей. В хрома­тине, прочно связанным с ядерным матриксом, нако­пление окисленных липидов происходило во время пика репликации ДНК.

Рисунок 1. Изменение ИОДК во фракциях хроматина, различающегося степенью прикрепления к ядерному мат­риксу.

Рисунок 2. Изменение ИОТК во фракциях хроматина, различающегося степенью прикрепления к ядерному мат­риксу.

Уровень вторичного продукта пероксидации ли­пидов малонового диальдегида, определяемого в сумме ТБК-реактивных продуктов, максимально на­капливался во второй фракции растворимого хрома­тина и хроматина, связанного с ядерным матриксом, в период высокой транскрипционной активности (рис. 3). При репликации ДНК уровень МДА в хроматине оставался высоким, но при этом формировалась тен­денция понижения содержания ТБК-реактивных про­дуктов.

Рисунок 3. Изменение содержания ТБК - активных продуктов во фракциях хроматина, различающегося проч­ностью прикрепления к ядерному матриксу

Наличие в печени большого запаса антиоксидан­тов, обладающих различным механизмом действия, высокого репаративного потенциала, подчинение ме­таболизма строгой гормональной регуляции опреде­ляет относительно небольшой подъем уровней про­дуктов пероксидации липидов хроматина во время регенерации. В тоже время, интенсивность перекис­ного окисления липидов хроматина, различающегося прочностью прикрепления к ядерному матриксу и структурной организацией, может изменяться под влиянием качественных особенностей и количествен­ного состава липидов, принимающих важное участие в структурно-функциональной организации ДНК на разных ее уровнях.

  1. Бойков П. Я., Костюк В. Г., Терентьев А. А., Шевченко Н. А. Концентрирование протоонкогенов в ядрах гепатоцитов / Молекулярная биология. 1995.- Т.29. №5. с. 1137-1144.
  2. Досон Р., Элиот Д..Элиот У., Джонс К. Спра­вочник биохимика. М: Мир.- 1991. 544с.
  3. Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов.-М.: Мир.- 1975.- 322 с.
  4. Стручков В.А., Стражевская Н.Б. Структур­ные и функциональные аспекты ядерных липидов нормальных и опухолевых клеток / Биохимия. 2000.- Т.65.- №5. с. 620-643.