Установлено, что колебание уровней гормонов в динамике эстрального цикла (ЭЦ) влияет на связывание нейронами 3Н-эстрадиола на территории заднего отдела МК [2]. Можно полагать, что это сопровождается изменением интенсивности нуклеиново-кислого обмена, однако, такие исследования ранее не проводились.
Целью работы являлось изучение структурной организации и состояния нуклеиново-кислого обмена в нейронах заднего отдела МК в различные фазы ЭЦ.
Материал и методы. Исследования проведены на 20 самках крыс половозрелого возраста линии Вистар, весом тела 200-250 г. с регулярным ЭЦ, стадии которого определяли по цитологической картине влагалищных мазков. Животных декапитировали на стадии эструса и метэструса. Для изучения цитологических характеристик нейронов при световой микроскопии мозг 10 крыс (по 5 особей на каждую стадию) фиксировали в 10% -ном формалине. Материал заливали в парафин и готовили 7-10 мкм фронтальные срезы, которые окрашивали по Эйнарсону на нуклеиновые кислоты. Число «темных» и «светлых» клеток подсчитывали с помощью морфометрической сетки в окуляре в пяти полях зрения у каждого животного. 3Н-уридин (удельная радиоактивность 28 Ки/мМ) вводили внутрибрюшинно в дозе 160 МБк/г (по 5 крыс для каждой стадии) за один час до фиксации материала. Кусочки МК фиксировали 12 ч в смеси формалин - спирт - ледяная уксусная кислота в холодильнике. Готовили парафиновые срезы толщиной 5 мкм, депарафинировали их и покрывали фотоэмульсией типа ПР-2М с экспозицией 1 месяц. После проявления и фиксации автографов препараты окрашивали гематоксилином с эозином. Интенсивность включения изотопа оценивали по числу зерен восстановленного серебра на единицу площади объекта (100 μ2) в десяти полях зрения с учетом фона вне среза.
Результаты. Дорсомедиальное ядро (Med) представляет собой компактное скопление нейронов малого и среднего размера, расположенное около стенки бокового желудочка. Оно образовано длинноаксонными редковетвистыми нейронами, которые в препаратах, окрашенных крезилом фиолетовым, носят характер кариохромных. Изучение цитологических характеристик нейронов Med в препаратах, окрашенных на нуклеиновые кислоты по Эйнарсону, показало, что они различаются по сродству к красителю и носят характер «темных» и «светлых». Подсчет количества «темных» и «светлых» клеток на стадиях эструса и метэструса показали, что при смене стадий ЭЦ изменяется их соотношение. Так на стадии эструс на долю «светлых» клеток приходится 60-65%, в метэструсе доля «темных» клеток составляет 58-62%.
В автографах Med белых крыс, которым был введен 3Н-уридин, зерна восстановленного серебра обнаруживали преимущественно в ядрах нейронов и реже - в цитоплазме. Подсчет зерен серебра на единицу площади объекта показал, что у крыс на стадии эструс он равен 10,45+0,89, метэструс - 8.29+0,27. Сравнение вариационных рядов групповых средних показало, что выявившиеся различия являются статистически значимыми (р<0,01).
Заднее кортикальное ядро (Сор) на основании своих цитоархитектонических характеристик может быть подразделено на медиальную и латеральную части. В его медиальной части (Сорm) преобладают редковетвистые нейроны, при этом у определенной части этих нейронов имеет место поляризация тел и отростков, вследствие чего они приобретают признаки корковых нейронов. Длинноаксонные густоветвистые нейроны встречаются в виде отдельных клеток или небольших групп. В латеральной части этого ядра с появлением явлений стратификации, количество густоветвистых нейронов становится больше, они концентрируются в поверхностной клеточной зоне и носят характер веретенообразных и пирамидообразных нейронов. В глубокой клеточной зоне преобладают короткодендритные и ретикулярные нейроны, а также встречаются густоветвистые нейроны подкоркового типа.
Исследование цитологических особенностей нейронов Сор позволило выделить среди них три основных группы, которые названы кариохромными, светлыми и цитохромными. Для кариохромных нейронов характерно наличие крупного, гиперхромного клеточного ядра, узкого перикариона, содержащего пылевидную базофильную зернистость. У светлых нейронов крупное, богатое эухроматином клеточное ядро, более массивный ободок цитоплазмы с отдельными глыбками базофильного вещества. Цитохромные нейроны обладают широким перикарионом, содержащим тельца Ниссля, и имеют светлое богатое эухроматином клеточное ядро с крупным ядрышком.
Представительство кариохромных, светлых и цитохромных нейронов в составе рассматриваемых ядер различно. Med преобладали кариохромные нейроны, в COp все три типа клеток найдены примерно в равных соотношениях. В препаратах СОр, окрашенных на нуклеиновые кислоты по Эйнарсону, определялись не только «темные» и «светлые» клетки, но и переходные между ними формы. При этом изменение их соотношения в изученные стадии ЭЦ показало, что процент «светлых» клеток в стадию эструса было равным 42%, остальное приходилось на «темные» и переходные формы, на стадии метэструса процент «темных» клеток составлял 35-37%.
Подсчет зерен серебра на единицу площади объекта в Сор показал, что у крыс на стадии эструс он равен 7,89 + 1,49 в медиальной и 8,01 + 1,12 в латеральной части ядра. На стадии метэструс - соответственно 8,09 + 1,87 и 9,03 + 2,33. Сравнение вариационных рядов групповых средних, отражающих интенсивность включения изотопа в двух частях Сор на стадиях эструса и метэструса, показало, что выявившиеся различия не достоверны (р>0,05).
Пириформная кора (РС) - структура палеокортекса и в ее составе преобладают длинноаксонные густоветвистые нейроны коркового типа, по своей цитологической характеристике являющиеся цитохромными нейронами. Подсчет меток на территории этой структуры показал, что на стадии эструса их количество равно 11,39 + 1,48, на стадии метэструса их количество уменьшается и составляет 9,41 + 0,22. Выявившиеся различия не являются достоверными (р>0,05).
Обсуждение. Наличие рецепторов к половым стероидам в нейронах заднего отдела МК предопределяет изменение их функциональной активности в ответ на колебания уровней этих гормонов, имеющее место в ЭЦ. Известно, что самые низкие уровни эстрадиола и ЛГ имеют место в метэструсе, пик эстрогенов отмечен в 12 ч стадии проэструса, а ЛГ - в 18 ч этой же стадии ЭЦ [3]. Выброс ЛГ на фоне повышения концентрации эстрогенов приводит к овуляции, которая происходит в эструсе.
В ранее проведенном исследовании получены данные о динамике 3Н-эстрадиолсвязываю-щей активности ткани заднего отдела МК в динамике ЭЦ [2]. Из них следует, что в метэструсе отмечается наибольшее содержание эстрогенных рецепторов, количество их снижается в диэструсе, становясь минимальным в проэструсе и эструсе. Опираясь на эти данные, мы посчитали целесообразным проведение исследования состояния нуклеиново-кислого обмена в структурах заднего отдела MК в стадии эструс и метэструс ЭЦ, полагая, что в этих условиях можно будет обнаружить происходящие в нем сдвиги.
Изучение цитологических характеристик нейронов Med в препаратах, окрашенных на нуклеиновые кислоты, и подсчет количества «темных» и «светлых» клеток на стадии эструс и метэструс показали, что при смене стадий ЭЦ изменяется их соотношение. Можно полагать, что нейроны MК под влиянием гормональных факторов способны возвращаться в некое исходное состояние, для того чтобы вновь его изменить в следующую фазу ЭЦ, т.е. имеет место явление реверсии, широко представленное среди нейросекреторных клеток [5].
Часть нейронов Med, Сор и РС, по-видимому, или не реагируют на колебания уровней половых стероидов (вследствие временной десенсибилизации к действию гормонов), или реагируют асинхронно. Предполагать последнее позволяют сведения о гетерогенности эстрогенных рецепторов, в составе которых выделено два подтипа: эстрогенные рецепторы a-типа и b-типа [15]. Показано, что их биологическое значение существенно различается: если рецепторы субтипа a способны, формируя гормон-рецепторные комплексы, оказывать активизирующее действие на транскрипционные процессы в клетке, то субтипа b - ингибирующее [6,13].
Приведенные выше данные могут быть объяснены на основании механизма действия половых стероидов на геном клетки [7]. Известно, что эти гормоны легко проникают в клетку и связываются со специфическими рецепторами в цитоплазме, формируя гормон-рецепторные комплексы. Ядерная транслокация гормон-рецепторных комплексов вызывает активацию генома вследствие их взаимодействия с акцепторными местами хроматина. К последним могут быть причислены участки генома, которые кодируют гормонзависимые РНК. Это обеспечивает интенсивный синтез белка в клетке, идущего на создание необходимого пула цитозольных рецепторов, представляющих собой гидрофильные белки, а также других веществ, обладающих свойствами секретов - аргинин-вазопрессина, энкефалина, субстанции Р, катехоламинов [10,11,12,13,16,19].
Полученные нами результаты методом авторадиографии показали, что интенсивность включения 3Н-уридина была больше в эструсе. Наши данные согласуются с результатами исследований [8,9]. Однако, хотелось бы заметить, что вопрос о большей или меньшей активности метаболизма в «темных» и «светлых» клетках должен всегда обсуждаться конкретно к рассматриваемым процессам. На стадии эструса, вероятно, можно говорить о большей активности транскрипционных процессов, а на стадии метэструса - процессов трансляции, проявляющихся высокими уровнями синтеза белка.
Имевшее место изменение интенсивности включения 3Н-уридина в нейроны Сор и РС на стадиях эструса и метэструса не достигало уровня значимости. Это обстоятельство, вероятно, можно объяснить наличием в их составе меньшего количества нейроэндокринных нейронов, или большей гетерогенностью находящихся в структурах Сор и РС эстрогенных рецепторов.
Авторы приносят свою благодарность зав. кафедрой гистологии Военно-медицинской Академии проф., д.б.н. Р.К.Данилову за помощь в проведении авторадиографических исследований.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта МО РФ PD 02-1.4-93
ЛИТЕРАТУРА:
- Акмаев И.Г., Калимуллина Л.Б. 1993. Миндалевидный комплекс мозга: функциональная морфология и нейроэндокринология. М.: Наука, 269 с.
- Асрибекова М.К., Калимуллина Л.Б.// Бюлл. эксп. биол. и мед. 1989. Т.107, №. 10, С.748.
- Бабичев В.Н. В кн. Физиология гормональной регуляции. 1986, Л.: Наука, С.70.
- Бериташвили B.C. Гагрские беседы: Структура и функция архипалеокортекса. М.: Наука, 1968. С.289.
- Гарлов П.Е.// Цитология. 2002. Т.44.№ 8. С. 747.
- Ишунина Т.А., Должиков А.А., Гриневич В.В.// Успехи физиол. наук. 2001.Т.32. №1. С.48.
- Розен В.Б. В кн.: Физиология гормональной рецепции. Л.: Наука, 1986.С. 5.
- Рублева З.Я., Савулев Ю.И., Пылаев А.С.// Ж-л невропатологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 1977.Т.7.№7.С.966.
- Салович Е.А., Пальцын А.А., Туманов В.П.// Бюлл. экспер. биол. и мед. 1981.Т.91.№4.С. 498.
- Чепурнов С.А., Чепурнова Н.Е. Миндалевидный комплекс мозга М.: Изд-во МГУ, 1981. 255с.
- Чепурнов С. А., Чепурнова Н.Е. Нейропептиды и миндалина. М. : Изд-во МГУ, 1985.128 с.
- Asmus S., Neuman S. // J. Neurobiol. 1994. V.25. P.156
- Isgor C.et al. // Brain Res.Mol. Brain Res.2002 V.106.P. 30.
- Kondo Y.,Sachs B.D.,Sakuma Y. // Behav. Brain. Res. 1998. V.91, №1-2, P 215.
- Kuiper G.G.J.M. et al.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P 5925
- Plumari L.et al. // J.of Neuroendocrinology. 2002. V.14.P. 971.
- Ramhres-Amaya V., Alvares-Borda B., Bermzdes-Rattoni F. // Brain Behav. Immun. 1998.V 12. №2. P.140
- Sato M.et al. // Neurosci. Res. 1987.V.5. P.131.
- Sinchak K. et al. // Physiol Behav. 2000. V.69. P.425.
- Takeshita H. // Yonago acta med.1976.V. 20. P.125.