Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

SCALE-UP PROBLEMS OF AQUEOUS ENZYMATIC HYDROLYSIS OF NITRIC-ACID PRETREATMENT PRODUCT OF OAT HULLS AS A NUTRIENT BROTH FOR BACTERIAL CELLULOSE BIOSYNTHESIS

Baybakova O.V. 1
1 Institute for Problems of Chemical and Energetic Technologies Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (IPCET SB RAS)
This study deals with difficulties of passing to aqueous medium during enzymatic hydrolysis. The complexity of scaling up enzymatic hydrolysis by volume in aqueous medium was investigated. It was found while passing from acetate buffer to aqueous medium that the yield of reducing sugars (RS) decreased by 4,1 % of the substrate weight. The RS concentration was exponentially increasing and reached the values ranging from 32,3 ± 0,2 to 48,8 ± 0,2 g/L in 24 h after the enzymatic hydrolysis started, as demonstrated by the RS concentration profiles. When the enzymatic hydrolysis was scaled up stepwise by volume in aqueous medium, the RS yield diminished: in an 11-L flask, the yield lowered 9 % more and was 64,3 ± 0,2 % on substrate weight basis. The enzymatic hydrolysis performed in a 63-L vessel with constant monitoring and adjustment of pH afforded a 66,0 ± 0,2 % RS yield on substrate weight basis.
oat hulls
nitric-acid pretreatment
enzymatic hydrolysis
nutrient broth
bacterial cellulose
production environment

Стремительное развитие биотехнологической промышленности стало одним из ключевых трендов мировой науки. Особое внимание при этом уделяется процессу биосинтеза бактериальной целлюлозы (БЦ) [1]. Ученые всего мира считают БЦ уникальным материалом будущего, который может быть использован в различных отраслях. Широкое применение БЦ нашла в медицине – гель-пленки БЦ можно использовать в микрохирургии при протезировании кровеносных сосудов [1], также на их основе можно восстанавливать суставные хрящи у больных, страдающих от болей в суставах и потери подвижности. Для биосинтеза БЦ классической является стандартная синтетическая среда [2], она была многократно модифицирована, однакоо ее дороговизна увеличивает стоимость целевого продукта [2].

В ИПХЭТ СО РАН предложено получать питательную среду из отходов сельского хозяйства – плодовых оболочек овса (ПОО) [3]. Данный вид сырья сохраняет продовольственную безопасность страны и характеризуется массовостью, доступностью, ежегодной возобновляемостью и низкой себестоимостью. Ранее нашим коллективом плодовые оболочки овса использовались в качестве сырья для получения биоэтанола [4], кормового белка [5], нитратов целлюлозы [6].

В данной работе рассматриваются проблемы получения питательной среды методом ферментативного гидролиза, в качестве субстрата для которого используется продукт азотнокислой обработки (ПАО) ПОО. Предварительная обработка сырья в одну стадию разбавленным раствором азотной кислоты позволяет достичь высоких результатов, поскольку химическое воздействие сочетает три функции: гидролиза, нитрования и окисления. Этот способ многократно апробирован в условиях опытно-промышленного производства ИПХЭТ СО РАН. Ферментативный гидролиз полученных субстратов осуществляется промышленно доступными ферментными препаратами. Успешность проведения ферментативного гидролиза в производственных условиях не является очевидной. Это связано с необходимостью тщательной промывки субстратов от ингибиторов [7] на стадии предварительной химической обработки, а также с сохранением микробиологической чистоты биотехнологических процессов, проводимых в емкостном оборудовании.

Следует отметить, что процесс получения питательной среды характеризуется сложностью масштабирования, как на этапе предварительной обработки сырья [8], так и на этапе ферментативного гидролиза [9]. В Комплексной программе развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 г. № 1853п-П8 от 24 апреля 2012 г. обращается внимание на то, что в России полностью отсутствует система «масштабирования» научных биотехнологических разработок для целей промышленного производства и другие элементы биоэкономики, необходимые для преобразования научных знаний в коммерческие продукты. Таким образом, исследования возможности получения питательной среды в производственных условиях для биосинтеза БЦ являются актуальными.

Целью данной работы являлось исследование преодоления проблем получения питательной среды в производственных условиях из плодовых оболочек овса для биосинтеза бактериальной целлюлозы.

Материалы и методы исследования

Определение основных характеристик сырья до и после предварительной химической обработки (массовые доли (м.д.) целлюлозы по Кюршнеру, пентозанов, кислотонерастворимого лигнина, золы) проводилось по стандартным методикам [10]. Наработка субстратов проводилась на опытном производстве ИПХЭТ СО РАН согласно действующей нормативной документации.

Одностадийная обработка плодовых оболочек овса проводилась 4 %-ным раствором азотной кислоты при атмосферном давлении, температуре 90–96 °С в течение 4 ч, в результате был получен продукт азотнокислой обработки (ПАО) [4].

После азотнокислой обработки субстрат был промыт до нейтральной реакции и отжат на фильтр-прессе. Ферментативный гидролиз проводился в ацетатном буфере и водной среде в колбах Эрленмейера емкостью 0,5 л при концентрации субстрата 33,3 г/л, в водной среде при концентрации субстрата 60,0 г/л в трех вариантах: в колбах Эрленмейера емкостью 1 л, ферментере объемом 11 л и емкостном оборудовании объемом 63 л. Процесс ферментативного гидролиза проводился при непрерывном перемешивании с частотой колебаний 150 мин-1 в шейкере-инкубаторе «Unimax 1010». В работе использовались промышленно доступные ферментные препараты «Целлолюкс-А» (производитель ПО «Сиббиофарм», Бердск) и «Брюзайм BGX» (производитель «Polfa Tarchomin Pharmaceutical Works S.A.», Польша, для компании «Diadic International Inc.», США). Препарат «Целлолюкс-А» позиционируется на рынке как целлюлаза для расщепления некрахмалистых полисахаридов, «Брюзайм BGX» – как гемицеллюлаза. Температура ферментативного гидролиза составила 46–47 °С. Продолжительность ферментативного гидролиза составила 24 ч, при этом активная кислотность поддерживалась вручную на уровне 4,7–4,9.

Концентрация редуцирующих веществ (РВ) в пересчете на глюкозу определялась спектрофотометрическим методом с помощью реактива на основе 3,5-динитросалициловой кислоты на «UNICO UV-2804». Выход редуцирующих веществ (РВ) от массы субстрата рассчитан с учетом коэффициента 0,9, обусловленного присоединением молекулы воды к ангидроглюкозным остаткам соответствующих мономерных звеньев в результате ферментативного гидролиза.

Результаты исследования и их обсуждение

Химический состав сырья до и после обработки представлен в табл. 1.

Одностадийная обработка сырья раствором азотной кислоты приводит к следующим изменениям по сравнению с нативным сырьем: повышению массовой доли целлюлозы от (44,7 ± 0,2) % до (79,2 ± 0,3) %, снижению массовой доли пентозанов с (30,8 ± 0,2) % до (9,2 ± 0,2) % и уменьшению массовой доли кислотонерастворимого лигнина с (18,1 ± 0,1) % до (13,8 ± 0,1) %, при этом повысилась зольность. Продукт азотнокислой обработки ПОО представляет собой многокомпонентную смесь, включающую различные примеси, в том числе растворимые в осахаренном субстрате продукты окислительного нитрования лигнина. Однако достаточно высокая сумма гидролизуемых компонентов позволяет предположить высокую реакционную способность субстрата к ферментативному гидролизу и успешность дальнейшего синтеза бактериальной целлюлозы.

Работы по исследованию ферментативного гидролиза в ацетатном буфере ПАО ПОО [11] позволили сделать оптимистический прогноз относительно возможности получения питательной среды в производственных условиях для биосинтеза бактериальной целлюлозы – для начальной концентрации ПАО ПОО 33,3 г/л выход РВ составил 91,4 % от массы субстрата.

Таблица 1

Химический состав сырья до и после предварительной химической обработки

Наименование

Массовая доля, %

Сумма гидролизуемых компонентов, %

целлюлозы

пентозанов

лигнина

золы

Плодовые оболочки овса

44,7 ± 0,2

30,8 ± 0,2

18,1 ± 0,1

4,6 ± 0,1

75,5 ± 0,3

Продукт азотнокислой обработки

79,2 ± 0,3

9,2 ± 0,2

13,8 ± 0,1

8,2 ± 0,1

88,4 ± 0,3

Таблица 2

Результаты проведения ферментативного гидролиза в лабораторных условиях (колбах Эйленмейера) в ацетатном буфере и водной среде, а также при масштабировании процесса в ферментере и в производственных условиях (емкостном оборудовании)

Показатель

Колба,

объем

0,5 л

Колба, объем

0,5 л

Колба, объем 1 л

Ферментер, объем 11 л

Емкостное оборудование, объем 63 л

Среда для ферментативного гидролиза

ацетатный буфер [11]

водная среда

Начальная концентрация субстрата, г/л

33,3

60,0

Концентрация РВ, г/л

33,8 ± 0,2

32,3 ± 0,2

48,8 ± 0,2

42,8 ± 0,2

44,0 ± 0,2

Выход РВ, % от массы субстрата

91,4 ± 0,3

87,3 ± 0,3

73,3 ± 0,3

64,3 ± 0,2

66,0 ± 0,2

Опыты по исследованию ферментативного гидролиза были проведены поэтапно. Результаты проведения ферментативного гидролиза в лабораторных условиях (колбах Эйленмейера) в ацетатном буфере и водной среде, а также при масштабировании процесса в ферментере и в производственных условиях (емкостном оборудовании) отражены в табл. 2 и на рисунке.

Результаты, полученные в лабораторных условиях, а также при дальнейшем масштабировании процесса в ферментере и в емкостном оборудовании, демонстрируют схожий характер кривой зависимости концентрации РВ от продолжительности процесса ферментативного гидролиза (рисунок). Кривые накопления концентрации РВ показывают, что концентрация РВ увеличивалась экспоненциально и через 24 ч от начала ферментативного гидролиза достигла значений от (32,3 ± 0,2) г/л до (48,8 ± 0,2) г/л.

Концентрация РВ, полученная в результате ферментативного гидролиза в ацетатном буфере и водной среде (колбы объемом 0,5 л), практически совпадает и равна (33,8 ± 0,2) г/л и (32,3 ± 0,2) г/л соответственно. Это связано с тем, что проведение ферментативного гидролиза в водной среде в небольших объемах не осложнено трудностями корректировки активной кислотности, по сравнению с осуществлением процесса в емкостном оборудовании.

При получении питательной среды в емкостном оборудовании концентрация РВ снижается на 4,8 г/л по сравнению с результатами, полученными в колбе Эйленмейера (объем 1 л) и на 2,8 г/л по сравнению с ферментером. Это объясняется не только колебаниями активной кислотности в процессе ферментативного гидролиза, но и с недостаточной промывкой продукта азотнокислой обработки ПОО от ингибиторов на стадии предварительной химической обработки сырья, а также снижением активной кислотности в процессе ферментативного гидролиза и сложностью ее корректировки в производственных условиях вручную.

Проведение ферментативного гидролиза в ацетатном буфере при начальной концентрации субстрата 33,3 г/л (колба Эйленмейера, объем 0,5 л) позволяет достичь максимального выхода РВ от массы субстрата – (91,4 ± 0,3) %. Переход от ацетатного буфера при ферментативном гидролизе к водной среде является важным этапом для дальнейшего биосинтеза бактериальной целлюлозы, так как ацетатный буфер может оказывать ингибирующее действие на уксуснокислые бактерии и биосинтез бактериальной целлюлозы из-за избытка ацетат-ионов. Однако осуществить ферментативный гидролиз в водной среде сложнее по сравнению с ацетатным буфером, так как в процессе гидролиза снижается активная кислотность среды, что негативно влияет на биохимическую стабильность ферментных препаратов.

При ферментативном гидролизе в водной среде в колбе при начальной концентрации субстрата 33,3 г/л выход РВ снижается на 4,1 % и составляет (87,3 ± 0,3) % от массы субстрата, что связано с колебаниями активной кислотности при проведении процесса, так как в процессе ферментативного гидролиза наблюдается подкисление, а поскольку рН поддерживался на заданном уровне вручную, то периодически рН отклонялся.

baib1.wmf

Зависимость концентрации РВ от продолжительности процесса ферментативного гидролиза в ацетатном буфере и водной среде

При дальнейшем увеличении объема ферментативного водного гидролизата и начальной концентрации субстрата до 60 г/л, происходило еще большее снижение выхода РВ: в колбе объемом 1 л выход РВ составил (73,3 ± 0,3) % от массы субстрата, а при переходе к ферментеру объемом 11 л выход снизился еще на 9 % и составил (64,3 ± 0,2) % от массы субстрата. Таким образом, переход от ацетатного буфера к водной среде и дальнейшее масштабирование процесса ферментативного гидролиза по объему при одновременном повышении концентрации субстрата является сложной проблемой, требующей постоянного контроля активной кислотности на протяжении всего процесса. В связи с этим при переходе в производственные условия для реализации ферментативного гидролиза ПАО ПОО в емкостном оборудовании объемом 63 л было принято решение о ежечасном контроле и корректировке активной кислотности. Это позволило достичь положительных результатов – в емкостном оборудовании был получен выход РВ (66,0 ± 0,2) % от массы субстрата.

Выполненные исследования свидетельствуют о том, что для получения питательной среды в производственных условиях для последующего биосинтеза бактериальной целлюлозы возможно применение одностадийной химической обработки сырья раствором азотной кислоты.

В работе [12] показано, что максимальный выход БЦ (8,7–9,0 %) обеспечивается при начальной концентрации глюкозы в среде 20–25 г/л. Таким образом, можно сделать вывод, что полученная ферментативным способом в производственных условиях питательная среда с концентрацией РВ (44,0 ± 0,2) г/л из сельскохозяйственных отходов – плодовых оболочек овса, предварительно обработанных разбавленным раствором азотной кислоты, может быть пригодна для дальнейшего биосинтеза бактериальной целлюлозы.

Выводы

Исследована возможность получения питательной среды в производственных условиях ферментативным способом из продукта азотнокислой обработки плодовых оболочек овса в водной среде для биосинтеза бактериальной целлюлозы. По результатам работы выявлено, что при переходе от ацетатного буфера к водной среде в процессе ферментативного гидролиза при начальной концентрации субстрата 33,3 г/л наблюдается снижение концентрации редуцирующих веществ от (33,8 ± 0,2) г/л до (32,3 ± 0,2) г/л или на 4,1 % в пересчете на выход РВ от массы субстрата. Показано, что при поэтапном масштабировании ферментативного гидролиза по объему в водной среде при начальной концентрации субстрата 60,0 г/л происходит снижение выхода РВ: в колбе объемом 1 л выход РВ составил (73,3 ± 0,3) % от массы субстрата, а при переходе к ферментеру объемом 11 л выход снизился еще на 9 % и составил (64,3 ± 0,2) % от массы субстрата. Постоянный контроль и корректировка активной кислотности в емкостном оборудовании позволили получить выход РВ (66,0 ± 0,2) % от массы субстрата. Таким образом, установлено, что ферментативным гидролизом в водной среде при использовании ферментных препаратов Целлолюкс-А и Брюзайм BGX в производственных условиях можно получить питательную среду для последующего биосинтеза бактериальной целлюлозы из плодовых оболочек овса одностадийно обработанных раствором азотной кислоты.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 17-19-01054).