Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Широкое применение белковых пенообразователей в производстве ячеистых бетонов сдерживается их высокой стоимостью в сравнении с синтетическими аналогами. С другой стороны, известно, что белковые добавки практически не влияют на кинетику твердения цементного камня, не снижают прочность пенобетона, не оказывают отрицательного воздействия на здоровье человека и состояние окружающей среды. Решение проблемы высокой стоимости добавок ученые видят в одном из двух подходов: использовании отходов промышленности и сельского хозяйства в качестве источника белка или направленном синтезе поверхностно-активных веществ с пенообразующими свойствами за счет применения культур микроорганизмов. Второй подход находит все большее применение в строительном материаловедении [2, 3, 4].

Целью исследования стала разработка новой пенообразующей добавки белковой природы, сочетающей в себе преимущества белковых модификаторов и низкую себестоимость. Для этого было осуществлено совместное применение двух обозначенных выше подходов. Пенообразователь предложено получать на основе микробного белка грибной культуры, выращенной на крупнотоннажном отходе пищевой промышленности, а именно – послеспиртовой барде.

По результатам анализа литературных данных в качестве продуцента биомассы были выбраны три культуры микроорганизмов: Pleurotus ostreatus 813 (ВКПМ F-276), Geotrichum candidum C3-106 (ВКПМ F-220), Geotrichum candidum Б (ВКПМ F-267).

Поддержание культур вели на картофельном агаре. Режим стерилизации сред 121 °С в течение 20 мин. Культивирование микроорганизма с целью получения биомассы вели в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих по 100 мл среды. Засев производили в стерильных условиях кусочком агаризованной следы размером 0,5 см2. Культивирование вели при различных режимах (температура, число оборотов) в термостатируемом шейкере Environmental shaker – Inkubator ES-20/60 («BioSan») в течение 3–7 суток. Концентрацию биомассы в экспериментах определяли весовым методом: высушиванием при 105 °С осадка, полученного фильтрованием 10 мл культуральной жидкости через обеззоленный бумажный фильтр.

Гидролиз культуральной жидкости вели в круглодонных колбах объемом 500 мл. Вносили раствор щелочи до концентрации равной 0,2–1,0 моль/л, перемешивали и нагревали на водяной бане с обратным холодильником до температуры 93 °С. Продолжительность гидролиза составила 2–5 часов. Гидролизат охлаждали до 30–35 °С и нейтрализовали избыток щелочи 20 % раствором серной кислоты до рН 7,5–8,5 и фильтровали под вакуумом.

Химическая природа полученного пенообразователя была исследована методом ИК-спектроскопии на ИК-Фурье спектрофотометре IRAffinity-1 (Shimadzu). УФ-спектроскопия образца пенообразователя с концентрацией 0,04 % сухих веществ осуществлялась на регистрирующем спектрофотометре SPECORD UV VIS. Качественный состав фракции свободных аминокислот был определен посредством проведения тонкослойной хроматографии на пластинах Sorbfil ПТСХ-АФ-А (силикагель). Подвижная фаза была представлена смесью н-бутанол:ледяная уксусная кислота:дистиллированная вода в соотношении 4:1:1. На стартовую линию наносили пробу 1 % раствора ПАВ.

Определение плотности раствора ПАВ проводили пикнометрическим методом. Содержание сухих веществ – методом высушивания в бюксах при 95 °С. Определение поверхностного натяжения вели согласно методу наибольшего давления пузырьков на приборе Ребиндера. Измерение рН проводили с помощью рН meter Waterproof марки HI 98129.

Для определения кратности пены в пенообразователь добавляли расчетное количество стабилизатора (20 % раствора сульфата железа (II)) и доводили объем смеси водой до 50 мл, так чтобы концентрация сухих веществ соответствовала заданной. Раствор перемешивали при 3 000 об/мин в течение 3 минут в градуированной емкости с ценой деления шкалы равной 10 см3. Кратность пены рассчитывали как отношение объема пены к объему пенообразователя, взятому на проведение испытания. Устойчивость пены измеряли по ГОСТ 6948–81. Для этого измеряли время выделения из пены половины объема раствора ПАВ с помощью секундомера. Стабильность пены (водоотделение жидкости из пены за 1 час) определяли как объем жидкости, выделившийся из пены в течение одного часа в процентах к исходному объему ПАВ. Стабильность пены в растворе определяли согласно ОСН АПК 2.10.32.001-04. Были использованы методы математического планирования эксперимента.

Спиртовая барда имеет сложный состав, содержание белкового компонента составляет 3,5 % [6], поэтому она может служить сырьем для получения поверхностно-активных веществ белковой природы. Однако наряду с белком в ней присутствуют углеводы, являющиеся замедлителями схватывания, попадая в пенообразующую добавку они снижают прочность итогового пенобетона. Поэтому первой задачей исследования стал подбор микроорганизма, способного к использованию в качестве источника углерода углеводов спиртовой барды при незначительном потреблении белка. Культура должна эффективно накапливать биомассу при выращивании на барде, при этом должно происходить увеличение содержания пептидно-белковой фракции в культуральной жидкости.

Исследование способности культур Pleurotus ostreatus 813, Geotrichum candidum C3-106, Geotrichum candidum Б к росту на среде, содержащей барду, показало, что максимальную концентрацию биомассы равную 25 г/л накапливает штамм Geotrichum candidum C3-106.

Для увеличения содержания белка были подобраны условия культивирования штамма. Наиболее благоприятной для выращивания стала концентрация барды в культуральной жидкости равная 6 % по массе. В качестве источника азота было предложено использовать дрожжевой экстракт, пептон, нитрат натрия, сульфат аммония и мочевину. Исследование показало, что культура Geotrichum candidum C3-106 не усваивала мочевину и практически не использовала сульфат аммония. Использование дрожжевого экстракта и пептона приводило к увеличению себестоимости пенообразователя. При внесении в среду культивирования нитрата натрия в концентрации 0,1–0,5 % по массе количество накопленной биомассы увеличивалось и при концентрации соли 0,4 % по массе выход биомассы увеличивался на 13 % в сравнении с контрольным испытанием.

Определение оптимальной продолжительности культивирования вели выращиванием культуры в течение 10 суток с оценкой концентрации накопленной биомассы. Исследование показало, что при продолжительности культивирования более 6 суток прирост биомассы замедляется и культура переходит в стационарную фазу роста, поэтому целесообразно вести культивирование не более чем 5–6 суток.

Исследование влияния рН на выход биомассы микроорганизмов включало выращивание грибной культуры при рН из диапазона 3,0–11,0 с шагом 0,5 с последующей оценкой концентрации биомассы. Анализ показал, что максимальное накопление культуры происходит при рН равном 6,0. Однако допускается вести культивирование при рН 4,5–7,0, так как выход биомассы в этой области близок к максимальному. При снижении рН до 4,5 возможно смягчение режима стерилизации сред, так как он оказывает статическое действие на рост контаминантных культур. Культивирование Geotrichum candidum 3C-106 при интенсивности перемешивания 50, 100, 150, 200 и 250 об/мин показало, что целесообразным является увеличение интенсивности до 150 об/мин, при больших значениях прирост биомассы незначителен. Для оценки влияния температуры на выход биомассы культуру выращивали при температурах 24, 26, 28, 30 и 32 °С. Наибольший выход продукта наблюдался при температурах 26–28 °С. Выход биомассы Geotrichum candidum 3C-106 при выращивании в оптимальных условиях составил 33–35 г/л.

Полученная культуральная жидкость подвергалась щелочному гидролизу. Главными факторами, оказывающими наибольшее влияние на глубину гидролиза, являются концентрация щелочи, время гидролиза и температура. В работе [1] автор говорит о том, что использование температур 80–97 °С позволяет завершить гидролиз в короткие сроки. Для проведения эксперимента была выбрана температура 93 °С. Концентрация щелочи составила 0,6–1,0 моль/л, время гидролиза 1–5 часов. При постановке эксперимента использовали полный факторный план, включающий 15 точек, условия проведения гидролиза и свойства полученного гидролизата приведены в табл. 1.

Анализ полученных данных показал, что наиболее предпочтительным является режим гидролиза в течение 2-х часов при концентрации гидролизующего агента (NaOH) равной 1 моль/л. При этом достигается максимальная кратность пенообразующего раствора равная 14,5 и минимальное водоотделение – 0 %.

Исследования показали, что температура фильтрования гидролизата оказывает влияние на кратность добавки. Возможно, это связано с тем, что изменяется растворимость белковых молекул в растворе сульфата натрия, образующегося в процессе нейтрализации избытка щелочи по окончании гидролиза. Был проанализирован диапазон температур для фильтрования от 10 до 60 °С. Показано, что максимальная кратность наблюдалась для пенообразующей добавки, подвергнутой фильтрованию при температуре 35 °С.

Таблица 1

Условия проведения гидролиза

Рис. 1. Ик-спектр пенообразователя

Для установления природы пенообразователя был получен его ИК-спектр (рис. 1).

Наличие пика 1653 см–1 с несколькими сопровождающими его пиками говорит о характерном карбонильном поглощении, которое можно отнести к свободным аминокислотам, полипептидам и белкам. Пик амид-II (1559 см–1) свидетельствует о наличии вторичных амидов (пептидов, белков). Пик амид-II, (1600–1 650см–1) характеризующий присутствие первичных амидов, четко не выражен. В то же время пик 1405 см–1 косвенно свидетельствует о наличии первичных амидов (аминокислот). Пик при 3443 см–1, обусловлен валентными колебаниями NH вторичных амидов. О присутствии сульфат-ионов говорит наличие одного пика в области 1130–1080 см–1 и другого, меньшего по размеру, в диапазоне 680–610 см–1.

УФ-спектроскопия образца пенообразователя показала наличие пика при длине волны равной 280 нм, характерного для ароматических аминокислот. Тонкослойная хроматография пенообразующей добавки показала, что в анализируемом образце присутствовали все аминокислоты, но большую часть из них составляли: лейцин, глицин, глутаминовая кислота. Полученные данные позволяют с уверенностью говорить о белковой природе полученной добавки.

Результаты исследования основных свойств пенообразователя приведены в табл. 2.

Важнейшей характеристикой пенообразователя является кратность. На кратность рабочего раствора пенообразователя влияет большое число факторов, а именно: концентрация рабочего раствора, вид и количество вносимой добавки стабилизатора, время предварительной выдержки перед использованием, время вспенивания, температура воды, используемой для приготовления раствора, и рН пенообразователя.

Таблица 2

Свойства пенообразователя

Рис. 2. Зависимость выхода получаемой пены от концентрации пенообразователя

Для оценки влияния концентрации на кратность пенообразующего раствора был исследован диапазон концентраций 0,5–9,0 % мас. При концентрации выше 1,5 % мас. кратность превышает 10, водоотделение из пены за 1 час равно 0 %. Поэтому оптимальной концентрацией было решено считать ту, что позволяет получить наибольший объем пены из единицы объема исходного гидролизата. Установлено, что концентрация добавки равная 2 % обеспечивает максимальный выход пены при одинаковом расходе исходного гидролизата (рис. 2).

Одной из главных эксплуатационных характеристик пенообразователя является сохранение им свойств при длительном хранении и замораживании. Была исследована динамика изменения кратности и стабильности при хранении при температурах 9, 25 и 40 °С. Результаты показали, что пенообразователь можно хранить при температуре 9 °С в течение 6 месяцев без потери свойств. При температуре 40 °С потери от начальной кратности составили 5, 11 и 16 % в первый, второй и третий месяц хранения соответственно, что обусловлено микробиологической порчей добавки. Использование соли сульфат меди в количестве 0,5 % мас. позволяет увеличить сроки хранения при комнатной температуре до 6 месяцев. Замораживание пенообразователя привело к снижению кратности на 10,6 % относительно исходной, а водоотделение за 1 час не изменилось.

Хранение пенообразователя при пониженных температурах приводит к изменению растворимости пептидов и белков, поэтому особенно важно соблюдать условия использования, отраженные в табл. 3, позволяющие достигнуть максимальной кратности.

Главной характеристикой, определяющей возможность применения пенообразователя в технологии получения пенобетонов, служит стабильность пены в растворе. Взаимодействие молекул ПАВ с частицами цемента и наполнителя может приводить к сильному гашению пены, результатом которого становится увеличение плотности пенобетона, изменение его свойств. Поэтому применяемые в строительстве пены должны иметь коэффициент стойкости пены в растворе α не менее 0,8. Исследование показало, что коэффициент α белкового пенообразователя составил 92,2.

На основании полученных данных была создана схема периодического производства пенообразователя (рис. 3).

Таблица 3

Рекомендуемые условия использования пенообразователя

Рис. 3. Схема производства пенообразователя: А – лабораторный этап получения биомассы; Б – промышленный этап получения биомассы; В – переработка биомассы в пенообразователь; 1 – поддержание культуры на чашках Петри; 2 – выращивание на скошенных средах; 3 – приготовление инокулята в конических колбах; 4 – расходный бункер барды с дозатором; 5 – расходный бункер нитрата натрия с дозатором; 6 – расходный бункер воды с расходомером; 7 – расходный бункер кислоты с расходомером; 8 – смеситель для приготовления среды; 9 – лабораторный биореактор; 10 – промышленный биореактор; 11 – бункер-накопитель биомассы с дозатором; 12 – расходный бункер гидроксида натрия с дозатором; 13 – реактор; 14 – холодильник; 15 – нейтрализатор

Выводы

1. Оптимальная среда для выращивания Geotrichum candidum 3C-106 должна содержать 6 % послеспиртовой барды и 0,4 % нитрата натрия. Выращивание штамма ведут при рН среды 4,5, температуре 26–28 °С, в течение 5–6 суток и интенсивности перемешивания 150 об/мин.

2. Гидролиз белоксодержащего сырья следует проводить при 93 °С в течение 2 часов при концентрации NaOH равной 1 моль/л. Фильтровать гидролизат рекомендуется при температуре 35 °С.

3. Пенообразователь имеет белковую природу, содержит пептидные компоненты и свободные аминокислоты (глицин, глутамат, лейцин и т.д.). Плотность пенообразователя составляет 1,060–1,080 г/см3; рН – 7,5–8,5; содержание сухих веществ 9,8–10,0.

4. Температура хранения равная 9 °С обеспечивает сохранение свойств добавки в течение 6 месяцев. Использование сульфата меди в количестве 0,5 % по массе позволяет увеличить срок хранения при комнатной температуре до 6 месяцев. Замораживание приводит к снижению кратности пенообразователя на 10,6 % относительно исходной, водоотделение за 1 час не изменяется.

5. Рабочий раствор пенообразователя должен быть выдержан в течение 30 минут, содержать 2 % по массе сухих веществ, иметь рН 7–8, температура воды разбавления должна быть 40–60 °С, в качестве стабилизатора следует использовать сульфат железа (II) в концентрации 0,3 %, время вспенивания – 3 мин. Пенообразователь имеет кратность не ниже 10, водоотделение за 1 час из пены составляет 0 %. Коэффициент стойкости пены в растворе равен 92,2 %.

По результатам работы получен патент РФ 2597009 «Белковый пенообразователь» [5].