Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

SCREENING STRAINS OF FUNGI TRICHODERMA – BIODESTRUCTORS PHENOL

Bondar P.N. 1 Lyubyashkin A.V. 1
1 FGBOU VO «Sibirskij Gosudarstvennyj Tehnologicheskij Universitet»
In this work proposed the microbiological utilization of phenol strains of the genus Trichoderma, which are producers of enzymes capable of degrading phenolic compounds. It was shown that all tested strains except for species Trichoderma viride, exhibit extracellular phenoloxidase activity and have different sensitivity to a change in the phenol concentration in the environment. It has been established that the strains of the genus Trichoderma can grow on both solid and liquid salt medium with the addition of a phenol as the sole carbon and energy source at concentrations of 20, 50 and 70 mg / l. Based on the results of selected strains promising for biological degradation of phenol in surface and deep cultivation methods and to create a product based on Trichoderma in immersion biotech system.
phenol
trichoderma
biodegradation
phenoloxidase activity
surface and deep cultivation
1. Alimova, F.K. Biologicheskoe raznoobrazie vidov roda Trichoderma (Fungi, Ascomycetes, Hipocreales) i ih rol v funkcionirovanii mikrobioty i zashhite rastenij v agrocenozah razlichnyh pochvenno-klimaticheskih zon na territorii Respubliki Tatarstan: Diss. doktora biologicheskih nauk, Kazan, 2006.
2. Bolshova, T.A. Osnovy analiticheskoj himii: Ucheb. dlja vuzov, v 2 kn. / T.A. Bolshova, G.D. Brykina, A.V. Garmash i dr.; pod red. Ju.A.Zolotova. 2-e izd. M.: Vyssh. shk., 2002.
3. GN 2.1.5.689-98. PDK himicheskih veshhestv v vode vodnyh ob`ektov hozyaystvenno-pitevogo i kulturno-bytovogo vodopolzovaniya.
4. Mahova, E.G. Kultivirovanie gribov roda Trichoderma na lignouglevodnyh substratah i poluchenie biopreparata: avtoref. dis. kand. tehn. nauk. Krasnojarsk, 2003. 21 р.
5. Reshetnikova, I.A. Destrukcija lignina ksilotrofnymi makromicetami. Nakoplenie selena i frakcionirovanie ego izotopov mikroorganizmami. M.: SP Novinteh-Press, 1997. 202 р.
6. P?rez-Guerra, N. Main characteristics and applications of solid substrate fermentation / N. P?rez-Guerra, A. Torrado-Agrasar, C. L?pez-Macias and L. Pastrana // Electronic Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry. 2003. Vol. 2. no. 3. рр. 343–350;
7. Verma M. Antagonistic fungi, Trichoderma spp.: Panoply of biological control / M. Verma, Satinder K. Brar, R.D. Tyagi, R.Y. Surampalli, J.R. Val?ero // Biochemical Engineering Journal. 2007. Vol. 37. pp. 1–20.

Производные фенолов – наиболее распространенные загрязнения, поступающие в поверхностные воды со стоками предприятий нефтеперерабатывающей, сланцеперерабатывающей, лесохимической, коксохимической, целлюлозно-бумажной промышленности и др. Фенол и его гомологи являются трудно деструктирующимися соединениями, ингибирующими биосинтез микроорганизмов, что значительно затрудняет самоочистку водных объектов. Так, минимальные токсические дозы, уменьшающие на 50 % количество микроорганизмов, обеспечивающих обезвреживание опасных соединений в воде, для фенола, гидрохинона и катехина составляют всего лишь 22,1; 0,08; 31,8 мг/л соответственно. Таким образом, попадание в водоем даже незначительного количества фенольных соединений приводит к уменьшению способности водного объекта к саморегенерации с помощью имеющегося геобиоценоза и невозможности в дальнейшем дезактивации других загрязнений. Кроме того, фенол и его производные обладают высокой токсичностью для человека и относятся к высоко опасным веществам 2-го класса опасности. Предельно допустимая концентрация фенола в воде хозяйственно-питьевых и рыбохозяйственных объектов лимитирована до 0,001 мг/л [3].

Преимущество использования биологических методов деструкции объясняется тем, что микроорганизмы обезвреживают фенольные вещества, не оказывая отрицательного влияния на экосистему, и не вызывают появления новых загрязняющих агентов в окружающей среде. Деструктивные методы пригодны для вод с концентрацией фенолов до 1 г/л.

Способность видов рода Trichoderma утилизировать широкий набор углеродных субстратов, технологичность, сравнительно высокая скорость роста и низкая токсичность в отношении растений и животных предполагают возможность их использования, наряду с традиционными для этого рода отраслями биотехнологии, для биодеструкции фенольных соединений. Во многих работах было показано, что грибы рода Trichoderma могут быть весьма устойчивы к промышленным загрязнениям окружающей среды.

Целью работы был подбор активных штаммов рода Trichoderma для биологической деструкции фенола при поверхностном и глубинном культивировании.

Материалы и методы исследования

Для проведения исследований были отобраны 6 моноспоровых штаммов различных видов грибов рода Trichoderma, выделенных из почв различных лесорастительных зон Средней Сибири и Республики Тыва и обладающих стабильными культурально-морфологическими признаками: Trichoderma asperellum «Mg-6», Trichoderma asperellum «TH-11», Trichoderma harzianum «M99/5», Trichoderma koningii «ТСЛ-06», Trichoderma koningii «ТСГ», Trichoderma viride «Lg-1».

Фенолоксидазная активность штаммов рода Trichoderma определялась реакцией Бавендамма, широко используемой для быстрого отбора грибов с высокой активностью внеклеточной фенолоксидазы. Метод Бавендамма разработан для выявления оксидазной активности у дереворазрушающих базидиомицетов, однако используется и для дейтеромицетов, в том числе Trichoderma. Цветной реакцией Бавендамма обнаруживают не менее трех ферментов: п-дифенолоксидазу (лакказу), пероксидазу и 0-дифенолоксидазу (тирозиназу). В качестве субстрата был использован таннин, так как для дейтеромицетов из всех субстратов он признан универсальным [5]. Таннин добавлялся к агаризованной среде Чапека в количестве 0,2 %.

Для анализа изучаемые штаммы высевали на питательную среду Чапека следующего состава, г: глюкоза – 30,0; NaNO3 – 2,0; MgSO4 – 0,5; КCl – 0,5; K2HPO4 – 1,0; FeSO4 – 0,01; агар – 20,0, вода дистиллированная – 1000 мл с добавлением таннинов (0,1 г/л) вместо азотсодержащего соединения. Среду автоклавировали при 0,5 атм. в течение 30 минут, разливали в чашки Петри и засевали исследуемыми штаммами методом укола. Культивирование осуществляли в термостате при 25–27 °С в течение 9 суток. О выделении фенолоксидаз судили на основании появления пигмента в среде в процессе роста гриба. Тест считали положительным, если появлялась окрашенная зона агара под старым, молодым мицелием или за пределами роста колонии.

Для оценки способности роста штаммов Trichoderma в присутствии различных концентраций фенола, как единственного источника углеродного питания, использовали поверхностное и глубинное культивирование.

При поверхностном методе культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды в виде мицелиальной пленки, которая субстратным мицелием всасывает ингредиенты питательной среды, а воздушным мицелием формирует репродуктивные органы. Этот способ культивирования обеспечивает полный цикл развития гриба, но является более медленным процессом из-за интрагифального транспорта питательных веществ от субстратного мицелия к растущим терминальным клеткам воздушного мицелия [6]. Фенол добавляли в среду Чапека вместо глюкозы в концентрациях 20; 50; 70 мг/л. Споры гриба наносили уколом в среду петлей в центр чашки Петри. Результаты снимали на 7 сутки.

Глубинный метод культивирования заключается в выращивании микроорганизмов в жидкой питательной среде при периодическом перемешивании. Этот способ обеспечивает возможность интенсивного роста мицелия, накопление продуктов обмена и высокий уровень механизации процесса, но не обеспечивает полного цикла развития мицелиальным грибам, и стадия спороношения в этих условиях у фенотипа слабо выражена или совсем не осуществляется [7]. Для этого использовали питательную среду Чапека, без добавления агара, содержащую в качестве источника углерода фенол в концентрациях 20; 50; 70 мг/л. Результаты исследований снимали на 14 сутки.

Определение концентрации фенола после культивирования проводили фотометрическим методом [2]. Метод основан на образовании оранжево-желтого комплекса фенола с пара-нитроанилином в щелочной среде.

Аликвотную часть анализируемой сточной воды объемом, не превышающим 5 мл, переносили в колбу вместимостью 25 мл, добавляли 1 мл диазотированного раствора пара-нитроанилина и доводили до метки поглотительным раствором (натрий углекислый, раствор 8 г/л). Диазотированный пара-нитроанилин готовился следующим образом: навеску 0,01 г пара-нитроанилина растворяют в смеси 10 мл дистиллированной воды и 2,5 мл соляной кислоты. К образовавшемуся раствору прибавляют 2,5 мл раствора натрия азотистокислого и через несколько минут раствор разбавляют водой до 50 мл. Раствор готовят в день проведения анализа. Оптическую плотность определяли при длине волны λ = 440 нм в кювете с рабочей длиной λ = 20 мм, относительно холостой пробы.

Все исследования проводили в трех повторностях.

Результаты исследования и их обсуждение

Для разработки основ использования штаммов грибов рода Trichoderma в целях биодеструкции фенолов необходимо было провести оценку их фенолоксидазной активности. Существуют работы, доказывающие, что ряд штаммов грибов рода Trichoderma способен окислять фенольные соединения [1, 4, 5]. Фенолоксидазную активность грибов обнаруживали в появлении пигмента. В данной работе на основании теста Бавендамма на агаризованной среде с танином установлено, что все исследуемые штаммы растут на питательной среде с таннином, но наибольшую фенолоксидазную активность проявили 3 штамма: Trichoderma asperellum «ТН-11», Trichoderma koningii «ТСГ» и Trichoderma asperellum «Mg-6», диаметр пигментированных пятен составлял 48 ± 0,5, 42 ± 0,5 и 40 ± 0,3 мм соответственно. Изолят Trichoderma viride «Lg-1» не проявил оксидазную активность и в дальнейших исследованиях не использовался.

Проведенные исследования по влиянию фенола на рост штаммов Trichoderma в условиях поверхностного культивирования показали, что они обладают различной чувствительностью к изменению концентрации фенола в среде. Так, при концентрации фенола в среде 20 мг/л наибольшая продуктивность была отмечена у штаммов Trichoderma asperellum «TH-11», Trichoderma koningii «ТСГ» и Trichoderma harzianum «M99/5». При концентрации 50 мг/л – у штаммов Trichoderma asperellum «TH-11» и Trichoderma koningii «ТСГ», а при концентрации фенола в среде 70 мг/л – у штамма Trichoderma koningii «ТСГ». При этом высокие концентрации фенола (50 и 70 мг/л) ингибировали рост штамма Trichoderma harzianum «M99/5». Отрицательное действие фенола на продуктивность штаммов Trichoderma asperellum «Mg-6» и Trichoderma koningii «ТСЛ-06» проявилось при всех концентрациях (рис. 1).

pic_1.tif

Рис. 1. Коэффициенты активности роста грибов рода Trichoderma в присутствии различных концентраций фенола в среде

Оценку степени биодеструкции фенола исследуемыми штаммами проводили в условиях глубинного культивирования, в качестве источника углерода использовали фенол с концентрациями 20, 50 и 70 мг/л. Концентрацию фенола в среде до и после культивирования определяли фотоколориметрическим методом.

Анализ результатов экспериментальных испытаний показал, что во всех случаях штаммы рода Trichoderma способны подвергать деструкции фенол, содержащийся в среде. Добавление фенола в среду в концентрации 20 мг/л показало, что наибольшую степень деградации проявил штамм Trichoderma harzianum «M99/5» – концентрация снизилась на 30 %. Штаммы Trichoderma asperellum «Mg-6» и Trichoderma koningii «ТСЛ-06» снизили концентрацию на 17,5 и 15 % соответственно, а штаммы Trichoderma asperellum «TH-11» и Trichoderma koningii «ТСГ» – менее чем на 9 %.

При концентрации фенола в среде 50 мг/л характерна наибольшая, по сравнению с другими начальными концентрациями, эффективность биодеструкции. Так, наблюдалось существенное снижение его концентрации штаммом Trichoderma harzianum «M99/5» на 95,5 %, штаммы Trichoderma asperellum «Mg-6» и Trichoderma asperellum «TH-11» снизили концентрацию на 46,6 и 42 % соответственно, штаммы Trichoderma koningii «ТСЛ-06» и Trichoderma koningii «ТСГ» – на 39 %.

При концентрации фенола в среде 70 мг/л штаммы Trichoderma asperellum «TH-11», Trichoderma asperellum «Mg-6» и Trichoderma harzianum «M99/5» снизили его концентрацию на 17,2; 14,3 и 12,9 % соответственно, штаммы Trichoderma koningii «ТСЛ-06» и Trichoderma koningii «ТСГ» – на 11,4 % (рис. 2).

Выводы

Результаты экспериментальных испытаний показали, что исследуемые штаммы видов Trichoderma asperellum, Trichoderma koningii и Trichoderma harzianum проявляют внеклеточную фенолоксидазную активность, но обладают различной чувствительностью к изменению концентрации фенола в среде.

Скрининг штаммов для биодеструкции фенола показал, что при добавлении фенола в качестве единственного источника углерода и энергии в концентрациях 50–70 мг/л при поверхностном культивировании перспективными являются Trichoderma asperellum «TH-11» и Trichoderma koningii «ТСГ», а в условиях глубинного культивирования – Trichoderma harzianum «M99/5», Trichoderma asperellum «Mg-6», Trichoderma asperellum «TH-11», Trichoderma koningii «ТСГ».

В целях создания биопрепарата на основе триходермы при совмещении поверхностного и глубинного принципов культивирования в одной иммерсионной биотехнологической системе можно рекомендовать штаммы Trichoderma asperellum «TH-11» и Trichoderma koningii «ТСГ».