Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Исследование причин развития артериальной гипертензии (АГ), как одного из важнейших факторов риска возникновения сердечно-сосудистых заболеваний, является одним из наиболее приоритетных направлений в медицине. Это обусловлено значительным вкладом АГ в развитие кардиоваскулярной патологии (КВП), инвалидизации и смертности населения от ее осложнений. Известно, что около 40–50 % случаев АГ обусловлены генетически. Однако до настоящего момента не выяснены механизмы реализации данной генетической предрасположенности в связи с тем, что АГ является полигенным заболеванием, наследование которого не подчиняется классическим законам Менделя, а реализация генетической информации во многом зависит от внешних воздействий, которые легли в концепцию факторов риска.

В изучении природы АГ наибольший интерес представляют гены ренин-ангиотензиновой системы (РАС): ренина, ангиотензинпревращающего фермента (АПФ), ангиотензиногена, рецептора к ангиотензину II 1-го типа (АT1R). Результаты многочисленных работ в данном направлении показали, что именно повышение активности РАС, как циркуляторной, так и тканевой, во многом определяет развитие АГ, метаболического синдрома, атеросклероза и коронарной болезни сердца [2]. В отличие от циркулирующей РАС, для которой характерна регуляция гомеостатических параметров на уровне организма, локальные РАС проявляют пара- и аутокринные влияния, направленные на поддержание локального гомеостаза в тканях и органах [1]. Экспрессия молекул РАС установлена в миокарде, сосудистой стенке, жировой ткани, причем в естественных условиях они определяются в следовых количествах, а при КВП наблюдается их выраженная экспрессия. Гиперактивность тканевой РАС обуславливает нарушение структуры и функции органов и тканей, в которых она экспрессируется. Значение локальных РАС в развитии КВП во многом превышает таковое циркулирующей: именно активация тканевых РАС ответственна за ремоделирование сердца и сосудов, развитие сердечной недостаточности (СН), сахарного диабета 2-го типа, ретинопатии и нефропатии.

Основная эффекторная молекула РАС ангиотензин II (АнгII) – реализует свои патофизиологические эффекты посредством взаимодействия со своим рецептором AT1R [6]. Aнг II независимо принимает участие в развитии как АГ, так и атеросклероза, причем его роль в развитии атеросклероза представляется настолько значимой, что применение ингибиторов АПФ является стандартом лечения для всех пациентов с атеросклерозом. Поскольку уровень экспрессии AT1R определяет биологическую эффективность Анг II [7] и РАС в целом, изучение плотности AT1R и механизмов ее регуляции представляет особый интерес. Наиболее изучен полиморфный маркер А(1166)С гена АТ1R [4]. Большое количество исследований показало ассоциацию данного полиморфизма с развитием АГ, инфаркта миокарда, СН, нефропатии, однако расположение полиморфизма А(1166)С в некодирующей области гена всегда ставило под сомнение его функциональную значимость. Эксперименты in vitro продемонстрировали механизм взаимодействия специфической микро-РНК-155 с данным полиморфизмом, приводящий к посттранскрипционному подавлению экспрессии гена AT1R и, соответственно, изменению плотности рецептора AT1R в тканях [3].

Цель работы: изучить и сравнить уровень экспрессии АТ1R в гладкомышечных клетках сосудов (ГМКС) и выявить его возможную ассоциацию с различными генотипами полиморфизма А(1166)С гена AT1R у пациентов с АГ и мультифокальным атеросклерозом.

Материалы и методы исследования

Исследовано 30 резецированных во время плановых оперативных вмешательств участков артерий среднего калибра: 16 артерий пациентов с облитерирующим атеросклерозом нижних конечностей, во время выполнения реконструктивных операций, составивших 1-ю группу, и 14 интактных маммарных артерий, взятых в ходе операций аортокоронарного шунтирования у пациентов с многососудистым поражением коронарного русла, составивших 2-ю группу. Значимых различий между группами по полу, возрасту, выраженности АГ, коморбидным заболеваниям (сахарный диабет, ожирение и т.д.) не было.

Полученный материал помещали в нейтральный забуференный 10 %-й раствор формалина (pH 7,4) и фиксировали в течение 24 часов. После дегидратации кусочки заливали в парафин по стандартной методике. На ротационном микротоме ShandonFinesse 325 (ThermoScientific, США) изготавливали серийные гистологические срезы толщиной 4 мкм, которые затем окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Степень экспрессии рецепторов 1 типа к ангиотензину II в мышечном слое сосудов исследовали с помощью иммуногистохимической (ИГХ) методики. Для ИГХ-исследования срезы помещали на покрытые адгезивом стекла SuperFrostPlus (Menzel, Германия). Для «демаскирования» антигенов регидратированные срезы подвергали термической обработке в растворе TargetRetrievalSolution (DAKO, Дания) с использованием микроволновой печи Samsung CE118KFR. После блокирования неспецифического связывания белков протеиновым блоком (DAKO) и эндогенной пероксидазной активности пероксидазным блоком (DAKO) наносили первичные антитела. Использовали поликлональные антитела (ПАТ) к Anti-AGTR1 (SIGMA, Sweden). Визуализацию первичных антител проводили с помощью высокочувствительной полимерной системы детекции EnVisionFLEX+ (DAKO). В качестве субстрата для пероксидазы хрена использовали DAB+ (DAKO). Препараты окрашивали гематоксилином Майера. Далее окрашенные срезы заключали в полусинтетическую среду Eukit (Kaltek, Италия). Микроскопию препаратов и морфометрические исследования проводили на микроскопе Olympus AX70 Provis (Olympus, Япония) с помощью программы анализа изображения Analysis 3.2 Pro (SoftImaging, Германия) согласно рекомендациям производителя программного обеспечения. В каждом случае ИГХ-исследования экспрессию маркера Anti-AGTR1 в виде цитоплазматического или мембранного окрашивания коричневого цвета изучали в 30 полях зрения при увеличении 200. Интенсивность окрашивания рецепторов к ангиотензину II в мышечном слое артерий оценивали полуколичественно по проценту позитивных клеток согласно 3-уровневой шкале: «-», отрицательный (отсутствие позитивно окрашенных клеток); «+», очаговая или слабая экспрессия (< 50 % позитивных клеток); «++», диффузная или сильная позитивная реакция (> 50 % позитивных клеток) [5].

Для определения аллелей полиморфного участка А1166С гена AT1R использовали геномную ДНК, выделенную из венозной крови, смешанной с антикоагулянтами, путем фенол-хлороформной экстракции. Для идентификации полиморфизма А(1166)С амплифицировали выделенную ДНК методом полимеразной цепной реакции с использованием соответствующих праймеров на амплификаторе PHC-2 («Techne», Великобритания) с последующим рестрикционным анализом. Присутствие после рестрикции фрагмента длиной 166 п.н. означало наличие АА-генотипа, фрагментов 139 и 27 п.н. – СС-генотипа, фрагментов 166, 139 и 27 п.н. – АС-генотипа. Статистический анализ проводился с использованием статистического пакета SPSS с использованием критерия хи-квадрат. Статистически значимыми считали значения при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В обеих группах мы получили схожие результаты. В 1-й группе в 8 артериях (47,05 %) наблюдалась слабая или очаговая (+) экспрессия AT1R (рис. 2), в других 8 артериях экспрессия AT1R (47,05 %) была выраженной (++) (рис. 4), в 1 случае (5,9 %) экспрессия AT1R отсутствовала (-) (рис. 1). Во 2-й группе слабая или очаговая (+) экспрессия AT1R наблюдалась в 7 случаях (50 %) (рис. 5, 3), сильная (++) экспрессия AT1R – в 7 других случаях (50 %). В результате генотипирования и в 1-й, и во 2-й группах не было выявлено пациентов с генотипом СС полиморфизма А1166С гена АТ1Р, а генотипы АА и АС встречались с одинаковой частотой. И в 1-й, и во 2-й группе корреляция плотности рецепторов АТ1Р и вариантов полиморфизма гена АТ1Р выявлена не была (табл. 1). Таким образом, выраженная тканевая экспрессия наблюдалась примерно у 50 % пациентов с атеросклеротическим поражением артерий, причем она не зависела от исследуемого сосудистого русла (пораженного атеросклерозом или непораженного) и варианта полиморфизма гена АТ1R.

Распределение генотипов полиморфизма AT1R/A1166C: AA у 50 % (n = 8) и AC у 50 % (n = 8) пациентов 1-й группы, AA у 64,3 % (n = 9) и AC у 35,7 % (n = 5) пациентов во 2-й группе. Генотип СС не был выявлен ни в одном случае. Между уровнями экспрессии АТ1R и распределением генотипов AT1R/A1166C в 1-й и во 2-й группах не было найдено достоверных различий (р > 0,05). В обеих группах уровни экспрессии AT1R не были ассоциированы ни с генотипом АА, ни с генотипом АС AT1R/A1166C (табл. 2).

Таблица 1

Отсутствие различия (p = 0,626 по критерию хи-квадрат) распределения значений уровня экспрессии АТ1R в 1-й и во 2-й группах

Таблица 2

Отсутствие связи (p = 0,502 по критерию хи-квадрат) распределения значений уровня экспрессии гена АТ1R с генотипом AA и АС полиморфизма А(1166)С

Выводы

Результаты исследования позволяют сделать вывод о том, что активность РАС в ГМКС неоднородна среди пациентов с АГ и мультифокальным атеросклерозом, не зависит от генотипа полиморфизма А(1166)С гена AT1R. Уровни экспрессии AT1R в интактных артериях не отличаются от таковых в артериях, пораженных атеросклерозом (p > 0,05). У ряда пациентов с выраженным атеросклеротическим поражением артерий отсутствует экспрессия AT1R в ГМКС, что ставит под сомнение ведущую роль именно РАС в патогенезе ремоделирования сосудов в отдельных случаях.

Механизмы, влияющие на уровень экспрессии тканевых компонентов РАС, требуют дальнейшего изучения. Необходимо проведение исследований, выясняющих причину низкой подверженности маммарных артерий атеросклерозу в условиях высокой активности в них РАС при одновременном наличии выраженного поражения артерий других локализаций (например, выраженного коронарного атеросклероза). Возможно, исследование эффективности терапии блокаторами РАС (ингибиторами АПФ и сартанами) у пациентов с разной степенью экспрессии АТ1R в тканях позволит разработать методы прогнозирования эффективности терапии и индивидуализировать схему лечения.

Рецензенты:

Крутиков Е.С., д.м.н., профессор, зав. кафедрой пропедевтики внутренних болезней Медицинской академии им. С.И. Георгиевского, ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского», г. Симферополь;

Кубышкин А.В., д.м.н., профессор, зав. кафедрой общей и клинической патофизиологии Медицинской академии им. С.И. Георгиевского, ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского», г. Симферополь.