Ряд исследователей [1, 5] считают актуальным изучение воздействия психротолерантных мезофильных микроорганизмов на высшие организмы, так как были выявлены штаммы, оказывающие как положительное, так и отрицательное влияние на физиологические процессы у лабораторных животных.
Изменения на клеточном уровне, происходящие у высших организмов под воздействием изучаемых факторов, приводят к фенотипическим изменениям на организменном уровне. Для более объективной оценки воздействия микроорганизмов на макроорганизмы необходимо выявление общего вектора направленности течения митозстимуляционного эффекта воздействия. В доступных нам специальных литературных источниках мы не обнаружили системы оценки общего вектора направленности течения пролиферативных процессов, учитывающего митозстимуляционный эффект. В связи с вышеизложенным актуальность разработки комплексной балльной системы оценки процессов пролиферации, приводящей к цитоморфометрическим изменениям у высших организмов, не подлежит сомнению.
Цель исследования – выявить эффективность применения комплексной балльной системы оценки воздействия психротолерантных мезофильных микроорганизмов рода Ваcillus на течение пролиферативных процессов в корневой системе Allium сера L.
Материалы и методы исследования
Для гуманного обращения с животными согласно рекомендациям Каркищенко (2010) было решено использовать растительную тест-систему Allium-тест, которая позволяет оценить цито- и генотоксическое воздействие факторов различной природы на пролиферацию клеток корневой меристемы [8, 9].
Моделью исследования послужил вид лук репчатый (Allium сера L.), сорт российской селекции ВНИИССОК «Черный принц». Для проращивания использовали растения массой 10–20 г без зеленых листьев. От луковиц аккуратно скальпелем отрезали часть донца с омертвевшими клетками и отделяли сухие пленчатые наружные чешуи. Растительный материал выращивали без доступа солнечного света при температуре 20 ± 2 °С в центрифужных пробирках, заполненных 50 мл дистиллированной воды.
Через 48 ч проращивания для дальнейшего проведения эксперимента были отобраны луковицы, у которых средняя длина 10 крупных корней на одном растении составляла 18 ± 3 мм. В качестве критерия деления растений на экспериментальные группы была выбрана среда для проращивания: в первой экспериментальной группе (контроль) средой для проращивания послужил смыв дистиллированной воды с мясопептонного агара, во второй экспериментальной группе – суспензия бактериальных клеток концентрацией 1·106 м.кл./мл дистиллированной воды; в третьей экспериментальной группе – суспензия бактериальных клеток концентрацией 1·109 м.кл./мл дистиллированной воды; в четвертой экспериментальной группе – суспензия бактериальных клеток концентрацией 1·1012 м.кл./мл дистиллированной воды.
Бактерии рода Ваcillus штамм 2/09, идентифицированный по 16S RNA, высевали в 5 пробирок на мясопептонный агар (ТУ 9385-001-64786015-2012, г. Углич) и культивировали при температуре +36 °С в термостате в течение 24 ч. Затем производили смыв микроорганизмов из каждой пробирки 5 мл дистиллированной воды. Концентрацию микроорганизмов определяли культуральным методом предельных разведений по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) на агаризованной питательной среде в чашках Петри. После определения количества клеток бактерий в исходной суспензии плотность культур доводили до рабочей концентрации.
Выборка в каждой экспериментальной группе составила 10 луковиц. После 96 ч пребывания в среде для проращивания для каждого растения определяли среднюю длину 10 крупных корней, которые впоследствии помещали в фиксатор Кларка на 24 ч при температуре 5 °С. Для длительного хранения материал промывали в 96 % растворе этилового спирта и переносили его в 70 % раствор этилового спирта.
Из полученного материала готовили давленые цитологические препараты, которые были окрашены 2 % ацетоарсеином. Анализ препаратов и фотографии клеток корневой меристемы выполняли на микроскопе AxioImager A1 («Zeiss»), используя лицензионное программное обеспечение AxioVision 4.7.1 и видеокамеру AxioCam MRc5 («Zeiss»).
В каждой экспериментальной группе проанализировали 10 000 клеток на всех стадиях жизненного цикла. Для цитологического анализа выбирали цельные клетки округло-квадратной формы с хорошо прокрашенным хроматином. Рассчитывали митотический индекс и регистрировали следующие типы хромосомных аберраций: микроядра, мосты, фрагменты, отставания и забегания хромосом. Клетки с неопределенным типом аберраций регистрировали как клетки с патологиями ядерного аппарата. Митотический индекс и частоту встречаемости аберрантных клеток определяли по формулам, приведенным в работе B.A. Iwalokun, 2011.
Полученные данные в контрольном варианте принимали за 100 %. Длину корней, митотический индекс и количество клеток с патологиями ядерного аппарата в опытных вариантах так же выражали в процентах относительно контроля и экстраполировали в баллы, используя разработанную нами шкалу (рисунок).
Шкала комплексной балловой системы оценки результатов цито-, генотоксического и митозстимуляционного эффектов воздействия микроорганизмов на высшие организмы с учетом морфометрических и цитологических изменений в корневой системе Allium сера L: А – показатели: длина корней и митотический индекс; Б – показатель: количество клеток с патологиями ядерного аппарата
Статистическую обработку полученных данных проводили при помощи программы BioStat.
Результаты исследования и их обсуждение
В ходе исследования было выявлено, что психротолерантный мезофильный штамм бактерий рода Ваcillus достоверно не оказывает ингибирующего воздействия на морфометрический показатель – рост корневой системы Allium сера L. (таблица). При этом следует отметить, что данный штамм может проявлять цитотоксические свойства, так как во второй экспериментальной группе митотический индекс по сравнению с контролем снизился на 12,1 %, а в четвертой экспериментальной группе – увеличился на 15,5 %. Снижение митотической активности, на наш взгляд, объясняется негативным влиянием бактерий на хромосомный аппарат клеток, а стимуляция пролиферативных процессов – работой компенсационных механизмов, уменьшающих потерю клеток, вызванную нарушениями митоза, что совпадает с результатами В.Н. Калаева (2008) и С.И. Цитленок (2002). Статистически достоверных (p < 0,05) различий в выраженности митозстимуляционного эффекта воздействия изучаемого штамма между значениями в экспериментальных и контрольной группах не было выявлено.
Анализируя данные, приведенные в таблице, можно утверждать, что психрофильный штамм бактерий рода Ваcillus является генотоксикантом. Об отклонениях нормального течения митоза в опытных экспериментальных группах позволяет говорить увеличение количества клеток с индуцированными геномными мутациями. Во всех экспериментальных группах таких патологий. как фрагменты хромосом, мосты (на стадиях анафазы и телофазы) и микроядра (на стадии интерфазы), обнаружено не было, хромосомные аберрации были представлены отставаниями и забеганиями хромосом при их расхождении к полюсам в период анафазы. Исключением является четвертая экспериментальная группа, где были обнаружены фрагменты и мосты. Отставание и забегание хромосом связано с нарушением поведения последних на веретене деления; мосты являются следствием разрывов хромосом и объединения фрагментов, имеющих центромеры, в результате чего возникают дицентрики. Нами выявлено, что возникновение ди- и полицентрических хромосом задерживает наступление цитотомии, что коррелирует с полученными данными других авторов [4].
Выявленные в ходе эксперимента хромосомные аберрации, на наш взгляд, являются проявлением дестабилизации кариотипа и активации соматического мутагенеза. Хромосомные аберрации возникают в результате повреждений ДНК, которые приводят к разрыву двойной спирали. В дальнейшем, по литературным данные [7], эти повреждения могут или репарироваться, или фиксироваться, при этом либо обновляется оригинальная последовательность оснований, либо возникают генные мутации, хромосомные аберрации. Факторы, обладающие мутагенными свойствами, у всех эукариот в одинаковой степени индуцируют хромосомные аберрации, поэтому применение растительных тест-систем является экономичным подходом для изучения воздействия психротолерантных мезофильных микроорганизмов на высшие организмы.
Комплексная балльная система оценки влияния бактерий рода Ваcillus на пролиферацию клеток корневой меристемы Allium сера L. (в баллах)
|
Экспериментальная группа |
Прирост корней за 96 ч (в мм) |
Баллы |
Митотический индекс, % |
Баллы |
Количество клеток с патологиями ядерного аппарата, % |
Баллы |
Итоговая сумма баллов |
|
Первая (контрольная) |
3,5 ± 0,32 (100 %) |
0 |
5,8 ± 2,2 |
0 |
0,14 ± 0,03 (100 %) |
0 |
0 |
|
Вторая |
3,3 ± 0,49 (94,3 %) |
–0,3 |
5,1 ± 1,2* (87,9 %) |
–0,6* |
0,62 ± 0,02* (443 %) |
–0,8* |
–0,56 ± 0,25 –0,7 ± 0,14* |
|
Третья |
3,7 ± 0,29 (105,7 %) |
0,3 |
6 ± 1,4 (103,5 %) |
0,2 |
0,8 ± 0,02* (572 %) |
–1,2* |
–0,43 ± 0,71 –1,2* |
|
Четвертая |
3 ± 0,41 (85,7 %) |
–0,7 |
6,7 ± 1,5* (115,5 %) |
–0,8* |
1 ± 0,03* (714 %) |
–1,4* |
–0,97 ± 0,38 –1,1 ± 0,42* |
Примечание. Достоверность отличия опыта от интактного контроля (* – p < 0,05)
Заключение
На основании проведенных экспериментов мы убедились, что разработанная нами комплексная система балльной оценки позволяет объективно анализировать цито- и генотоксическое воздействие микроорганизмов на процессы пролиферации у высших организмов, о чем свидетельствует то, что бактерии рода Ваcillus штамма 2/09 способны изменять митотическую активность корневой меристематической ткани Allium сера L. и индуцировать такие аномалии ядерного аппарата клетки, как фрагменты, мосты, отставания и забегания хромосом.
Рецензенты:
Петухова Г.А., д.б.н., профессор, ФГБОУ ВПО «Тюменский государственный университет» Министерства образования и науки России, г. Тюмень;
Дуров А.М., д.м.н., профессор, ФГБОУ ВПО «Тюменский государственный университет» Министерства образования и науки России, г. Тюмень.