Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

В настоящее время актуальность представляют прикладные и фундаментальные исследования по селекции перспективных штаммов винных дрожжей, способных улучшить качество игристых вин [8]. Наиболее распространенными винными дрожжами являются Saccharomyces сerevisiaе благодаря их толерантности к относительно высокому содержанию спирта (свыше 10–12 % об.), углекислому газу (6–7 г/дм3); рН (2,8–3,2), сернистому ангидриду (50–200 мг/дм3), повышенному давлению (до 0,5 МПа), холодостойкости (8–15 °С), диоксиду серы. Количество биохимически активных компонентов, содержащихся в вине, зависит от многих факторов: генетических особенностей дрожжей; содержания предшественников вкуса и аромата (аминокислот, ферментов, липидов, полисахаридов, фенольных веществ и других соединений) в составе среды брожения; наличия киллер-фактора, технологии производства игристого вина и других факторов.

Известны отечественные культуры дрожжей, используемые для производства шампанского, S. vini: Ш-39, ШП-1, МШ, 5/82, Штейнберг-1892, Харьковская-39, Ш-2, Ш-5, М-1 и расы зарубежной селекции S. cerevisiae MC001 и MC002, Litto-Levure [3, 6, 10]. Однако штаммы сухих дрожжей зарубежных производителей не всегда адаптированы к особенностям отечественного шампанского производства, что отражается негативно на качестве продукции. Кроме того, практика показала, что штаммы, применявшиеся в промышленности несколько десятков лет, постепенно теряют свои ценные признаки и свойства. Поэтому большое значение придается селекции дрожжей, применяемых в производстве шампанского, адаптированных к условиям предприятия.

Цель настоящей работы – получение штамма дрожжей S. cerevisiae, обладающего высокой бродильной активностью, способного сохранять биохимические и технологические свойства в процессе шампанизации.

Материалы и методы исследований

В работе были использованы винные штаммы Saccharomyces cerevisiae Y-3980 (Всеросссийская коллекция промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика), выделенный из шампанизируемого вина на ОАО «Дербентский завод игристых вин» (г. Дербент), и исходный Saccharomyces cerevisiae Litto-Levure, который служил в качестве контроля.

Селекция и морфо-физиологические свойства выделенных штаммов. Выделение чистой культуры из резервуаров на стадии дображивания бродильной смеси периодическим способом на брют осуществлялось путем последовательных рассевов в чашки Петри на плотную питательную среду, содержащую 2 % агара и виноградное сусло. Отбор дрожжей проводился методом Линдлера из более 260 колоний по морфологическим, культуральным, физиолого-биохимическим свойствам (бродильная способность, холодостойкость, устойчивость к сернистому ангидриду и повышенному давлению). Бродильную активность исследуемых штаммов оценивали по скорости сбраживания тиражной смеси с рН 3,3, содержащей 2,5 % углеводов в колбах с бродильными затворами до полной остановки брожения. Морфологию клеток (форма, величина клеток, способ вегетативного размножения) изучали в световом микроскопе «Olympus СХ21 FS1» (Япония). Спорообразование дрожжей индуцировали через двое суток на стандартной ацетатной среде, г/л: бактоагар – 20; СН₃СООNa – 10; KCL – 5. Диагностическая характеристика (способность усваивать азотистые вещества, органические кислоты, углеводы) штамма проводилась согласно общеизвестным методам [5].

Дрожжи культивировали в тиражной среде из следующих виноматериалов, %: Пино – 40, Рислинг – 20, Али – Готе – 20, Шардоне – 20. Бродильная смесь содержала 2,5 % углеводов, 11,2 % спирта; имела титруемую кислотность 9,1 г/дм3, летучую – 0,17 г/дм3; фенольные вещества составляли – 0,3 г/дм3, редуктоны – 17,8 г/дм3. Посевной материал, выросший на агаризованной среде и после 48 ч роста в глубинной культуре на виноградном сусле, составлял, 3 % от обьема среды. Шампанизация виноматериалов проводилась периодическим способом в акротофоре при 9–10 °С и давлении 0,4–0,5 МПа, рН 3,3–3,5 в течение 20 дней.

Молекулярно-генетические исследования. Таксономическую принадлежность штамма определяли по фенотипическим признакам до вида по определителям Кудрявцева [5]. Видовую идентификацию штамма Y-3980 проводили на основе анализа нуклеотидных последовательностей ITSI-5.8S-ITS2 региона рДНК. Выделение ДНК и проведение ПЦР выполняли по стандартной методике, описанной в работе [2]. Для амплификации использовали праймеры ITS1f (5,-CTTGGTCATTTAGAGAAGTA) и NL4 (5,-GGTCCGTGTTTCAAGACGG). Секвенирование амплифицированного фрагмента ДНК проводили в научно-производственной компании «Синтол» (Москва). Видовую идентификацию осуществляли сравнением полученных нуклеотидных последовательностей с данными, размещенными в генбанке NCBI (ncbi.nlm.nih.gov) и базе данных CBS (cbs.knaw.nl).

Ароматические вещества определяли методами масс-спектрометрии (ГХ МС) на ГХ МС НД 5988 А фирмы «Hewlett-Packard» (США) и газовой хроматографии – пламенно-ионизационным детектором (ГХ – ПИД) на ГХ ПИД НД – 5710 фирмы «Hewlett-Packard» (США) с платой сбора информации «Multichrom» фирмы «Ampersand» (Россия).

Свободные аминокислоты в шампанских винах определяли в стандартном режиме анализа белковых гидролизатов, используя высокоэффективные ионообменные колонки и специальный нингидриновый реагент для детектирования элюирующих аминокислот на жидкостном хроматографе L-8800 (Hitaсhi, Япония) по методике [9].

Жирные кислоты. Для получения метиловых эфиров жирных кислот из триглицеридов использовали метод прямой переэтерификации с метанольным раствором метилата натрия как описано [1]. Фракционирование метиловых эфиров жирных кислот в этаноле осуществляли методом газовой хроматографии на хроматографе «TRACE_2000» (Италия) с пламенно ионизационным детектором (PID) на капиллярной газохроматографической колонке HP-FFАР (США) (50 м×0,32 мм×0,52 мкм) с 10 % диэтиленгликоль – сукцинатом (США). Температура колонки 185 °С, испарителя – 230 °С. В качестве газоносителя использовали азот (1,8–2,7 дм3/ч).

Результаты рассчитывали как среднее арифметическое из трех повторных опытов с учетом средней ошибки.

Результаты исследования и их обсуждение

Культуральные свойства, морфология. В результате промышленной селекции выделен новый штамм дрожжей, который депонирован в Всеросссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика, под номером S. cerevisiae Y-3980. В тиражной смеси клетки нового штамма округлой формы размером 9,2×9,4 µкм, S. cerevisiae Litto-Levure – овально-округлые, удлиненные 8,3×10,1 µкм. Диаметр двадцатисуточной культуры S. cerevisiae Y-3980 составляет 4,3×3,8 см, S. cerevisiae Litto-Levure – 3,5×3,3 см. Штамм S. cerevisiae Y-3980 размножается почкованием, обладает способностью к спорообразованию и на 5–6-е сутки образует по 1–2 споры в клетке, форма спор шаровидная с гладкой стенкой, от одной до четырех в аске, размеры 2,5–2,9 µкм. После сбраживания тиражной смеси образуется зернистый осадок. S. cerevisiae Y-3980 формирует на поверхности агаризованной среды округлые макроколонии с волнистым краем, выпуклые, кремового цвета, с гладкой блестящей поверхностью, с врастающим в субстрат темно-палевым центром, небольшой радиальной складчатостью (рисунок). Макроколония исходного штамма (контроль) S. cerevisiae Litto-Levure имеет форму цветка неправильной формы с бежевыми концентрическими кругами, волнистым краем, c врастающим в субстрат темно-палевым центром; поверхность блестящая. Колонии имеют гомогенную структуру и мажущуюся консистенцию. Следует отметить, что некоторое изменение пигментации и аромата колоний дрожжей, возможно, имеет тесную корреляцию с образованием вторичных метаболитов, образованных в процессе спиртового брожения. Это летучие примеси, составляющие комплекс ароматических компонентов, количество которых формирует характерные сенсорные свойства конечного продукта брожения – этилового спирта.

Бродильная активность. Штамм S. cerevisiae Y-3980 обладает высокой бродильной активностью, сбраживает тиражную смесь на 48 ч быстрее контрольного штамма и образует спирт 11,3 об. %.

Биохимические свойства. Высшие спирты. Обнаружено, что при использовании штамма S. cerevisiae Y-3980 суммарное количество высших спиртов, составляющих основу в формировании букета шампанского, на 24 % больше по сравнению с контролем (табл. 1). Количество β-фенилэтанола c ароматом розы и пропанола в опытном шампанском выше в 1,4 и 1,6 раз, чем в контроле соответственно. Содержание изобутанола, оказывающего отрицательное влияние на букет шампанского, в 2,2 раза меньше в опытном шампанском по сравнению с контролем.

Терпеновые соединения. Выделенный штамм синтезирует вдвое больше, чем контрольный, такие терпеновые соединения, как гераниол, цис-фарнезол и транс-фарнезол, придающие аромату шампанского цитронные тона и оттенки аромата розы (табл. 2), что характерно для лучших образцов шампанского.

Сложные эфиры, являющиеся важнейшей ароматической составляющей, представлены 8 компонентами (табл. 3). Содержание этиллактата, гераниолацетата, диэтилмалата, улучшающих вкус, аромат и формирование в букете вина подсолнечных тонов, в опытном вине выше на 46,7; 50,0 и 20,7 % соответственно. Обнаружена более высокая доля высококипящих сложных эфиров в опытном варианте (66,1:73,7 %, контроль:опыт) по сравнению с легкокипящими, что является необходимым условием качества букета шампанского вина.

 а б

Макроколонии штаммов: а – S. cerevisiae Litto-Levure (исходный); б – S. cerevisiae Y-3980 (опытный) на сусло-агаре на 20-е сутки (натуральная величина)

Таблица 1

Содержание спиртов в шампанских винах, мг/дм3

Таблица 2

Содержание терпеновых соединений в шампанских винах, мг/дм3

Таблица 3

Содержание сложных эфиров в шампанских винах, мг/дм3

При использовании селекционированных винных рас дрожжей важная роль принадлежит полиненасыщенным жирным кислотам в качестве предшественников ряда биологически активных соединений и ответственных за травяной аромат шампанского. Большее накопление жирных кислот может оказывать влияние на игристые и пенистые свойства шампанского [7]. Доминирующее положение занимают пальмитиновая С16:0, линолевая С18:2ω-6 и линоэладиковая С18:2 кислоты,, составляющие до 35,0; 30,0 и 14,0 % от общей суммы жирных кислот, соответственно. Содержание жирных кислот С10:0 и С12:0, обуславливающих маслянисто-цветочный запах в шампанском, в 2 раза меньше, чем в контроле, что характеризует качество вина. Суммарное количество ненасыщенных жирных кислот (С14:1ω-9, С17:1, С18:2, С18:2ω-6, С24:1 ω-9) на 40,9 % выше в опытных вариантах, в основном, за счет линолевой С18:2ω-6 и линоэладиковой С18:2 кислот, соответственно на 45,3 и 36,1 %. Количество полиеновых кислот в опытном шампанском в 1,4 раза выше контрольного.

Исследование аминокислот, улучшающих аромат игристых вин, показало, что количество аминокислот в опытном варианте с использованием нового селекционного штамма превышает аналогичные показатели контроля почти в 1,3 раза. Количество незаменимых аминокислот (валин, лейцин, изолейцин, треонин, метионин, фенилаланин, лизин) в шампанском вине при использовании штамма S. cerevisiae Y-3980 вдвое выше контрольного образца. Как правило, содержание пролина доминирует в пуле аминокислот [8], концентрация его во всех вариантах шампанских вин составляет 49,0–55,2 % от суммы аминокислот. Количество метионина, цистеина и аланина в качестве антиоксидантов, оказывающих протекторный эффект на клеточные мембраны живого организма, выше в опытном вине в 1,5; 2,2 и 1,4 раза соответственно.

Шампанское марки «Брют», полученное с использованием штамма S. cerevisiae Y-3980, светло-соломенного цвета, с тонким ароматом, гармоничным вкусом, высокими игристыми и пенистыми свойствами, длительной игрой, средним мелкодисперсным пенообразованием. Шампанское имеет высокую оценку (9,2 балла). Получен Патент РФ № 2526493 [4].

Авторы выражают благодарность за помощь в проведении селекционных работ и полупроизводственных испытаний нового штамма для производства шампанского генеральному директору ОАО «Дербентский завод игристых вин» (г. Дербент) М.М. Садулаеву, зам. генерального директора Ю.Л. Пальян и сотрудникам научно-производственной компании «Синтол» (Москва) в проведении генетических исследований.

Рецензенты:

Аджиев А.Н., д.с.-х.н., профессор, генеральный директор Дагестанский научно-исследовательский, проектно-технологический институт виноградарства, садоводства и мелиорации «Агроэкопроект», г. Махачкала;

Омаров К.З., д.б.н., профессор, зав. лабораторией экологии, ФГБУН «Прикаспийский институт биологических ресурсов» Дагестанского научного центра Российской академии наук, г. Махачкала.