Пленкообразующие субстанции находят применение в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности [8]. Они перспективны при разработке биодеградируемых съедобных пленкообразующих материалов, обладающих барьерными свойствами. Этим требованиям отвечают структурные полимеры в составе панцирьсодержащего сырья (ПСС) гидробионтов – хитин и его простейшее производное хитозан, получаемый деацетилированием исходного биополимера (рис. 1). Барьерные свойства хитозановых субстанций обусловлены наличием у них бактериостатических и антиоксидантных свойств [3, 4].
Формовочные свойства хитозансодержащих субстанций зависят от молекулярной массы хитозана, степени его деацетилирования, массовой доли сухих веществ, природы и объемной доли органической кислоты в составе дисперсионной среды [6, 7].
Флуоресцентная спектроскопия является одним из высокочувствительных методов, позволяющих детектировать вещества в очень низких концентрациях с целью их идентификации. Она является чрезвычайно информативным методом, поскольку позволяет получать данные о структурных свойствах и ориентации, конформационной подвижности, комплексообразовании и в целом о межмолекулярных взаимодействиях. К достоинствам флуоресцентной спектроскопии относится также возможность неразрушающего контроля образца в ходе исследования [1, 2, 5].
Цель работы: обоснование условий идентификации хитозана в составе пленкообразуюших субстанций с использованием методов флуоресцентной спектроскопии.
Материалы и методы исследования
В качестве объектов исследования использовали образцы хитозана производства ЗАО «Биопрогресс» (ТУ 9289-067-00472124-03) с различной молекулярной массой: образец I (Мм = 260 кДа) и образец II (Мм = 350 кДа).
Пленкообразующие субстанции хитозана с массовой долей полимера 2 % получали путем диспергирования в органических кислотах: уксусной, янтарной, молочной, лимонной. Использовали растворы кислот с массовой долей 2–4 %.
Приготовление раствора 1-анилин-8-нафталинсульфаната (АНС): в связи с выраженным гидрофобным характером АНС в качестве растворителя использовали водно-спиртовой раствор с соотношением «спиртовая фаза: водная фаза – 1:9». Раствор АНС вносили в хитозановые дисперсии в дозировке 100 мкл на 2 см3 дисперсии.
Концентрацию АНС в образцах определяли спектрофотометрически на спектрофотометре «Промэколаб» в стеклянной кювете по воде, при длине волны 360 нм по следующей формуле:
где ε – коэффициент экстинкции, l – длина кюветы.
Спектральные свойства хитозановых дисперсий и пленок изучали на флуоресцентном двухлучевом сканирующем спектрофотометре PERKIN ELMER Lambda 800. Спектры флуоресценции регистрировали при 20 °С в зеркальной кювете с длиной оптического пути 1 см в диапазоне 400–550 нм (при возбуждении на 370 нм) и 430–500 нм (при возбуждении на 380 нм). Светопропускающие щели устанавливали по 8 мм. Образцы для флуоресцентных исследований, содержащие хитозан и гидрофобный краситель с концентрацией 1*10-6 моль/дм3, инкубировали в течение 2–3 часов при 20 °С. Спектры флуоресценции растворов красителей и хитозансодержащих композиций вычитались из спектров флуоресценции образцов.
При определении степени поляризации использовали длины волн возбуждения 380 нм и излучения – 430 нм. Светопропускающие цели устанавливали по 8 нм.
Величину светорассеяния определяли на спектрофлуориметре аналогично предыдущим опытам (в зеркальных кюветах) при скрещенных монохроматорах: при одинаковой длине волны 560 нм (щель 8 нм в первом монохроматоре и 1 нм во втором) в канал регистрации попадал рассеянный свет, пропорциональный размерам частиц и их количеству.
Хитозановые пленочные покрытия готовили из хитозановых субстанций с добавлением АНС с концентрацией 1,56*10-6 моль/дм3 методом растекания на полиэтиленовой, либо стеклянной подложке с последующим испарением кислоты на воздухе. Пленки выдерживали до испарения кислоты при комнатной температуре в течение 36–48 ч. Для исследования пленки наносились на покровные стекла и помещались в стеклянные кюветы по диагонали.
Спектры флуоресценции снимали в диапазоне 430–500 нм, при длине волны возбуждения 310 нм. Щели устанавливали по 5 нм на возбуждение и по 2,5 нм на излучение.
Результаты исследования и их обсуждение
В связи с тем что хитозан не обладает флуоресцирующими свойствами, была проведена работа по выбору хромофора, способного в наибольшей степени связываться с биополимером. При этом определяющим требованием к хромофору в случае детекции хитозана является его гидрофобный характер.
Гидрофобный хромофор будет связываться с гидрофобными участками на поверхности полимера. Изменение окружающего хромофор растворителя непосредственно влияет на спектр флуоресценции и поглощения, поэтому свободный и связанный красители можно различить оптическими методами. Если краситель заряжен, то поверхностный потенциал будет непосредственно влиять на сродство красителя к субстанции (положительно заряженные зонды связываются хитозаном сильно, отрицательно заряженные – слабо). При изменении поверхностного потенциала сродство красителя к поверхности будет меняться, что можно зарегистрировать по изменению его оптических свойств.
В качестве зондов для измерения поверхностного потенциала хитозановых субстанций использовали следующие флуорофоры: рибофлавин, родамин С и 1-анилино-8-нафталинсульфоната (АНС). Наилучшие результаты получены с использованием в качестве зонда высокочувствительного к изменениям поверхностного заряда полимера отрицательно заряженного красителя АНС.
В данном случае свободный краситель обладает крайне низкой интенсивностью флуоресценции. Уменьшение поверхностного заряда полимера приводит к увеличению связывания АНС и разгоранию его флуоресценции.
С помощью устройства, подключенного к ПК, снимали спектры излучения при возбуждении λ1 = 370 нм и λ2 = 400 нм.
Светорассеяние определяли в условных единицах по контролю – водно-спиртовому раствору хитозана (0) при λ1 = λ2 = 560 нм (щели на входе – по 8 мм, щели на выходе по 1 мм). Результаты представлены на рис. 2.
Рис. 1. Деацетилирование хитина с получением хитозана
а)
б)
Рис. 2. Спектры флуоресценции водно-спиртового раствора АНС в хитозановых дисперсиях: а – образец I; б – образец II
Спектральные характеристики кислоторастворимых субстанций хитозана
|
Вид системы |
Молекулярная масса хитозана, кДа |
Максимум флуоресценции, нм |
Полуширина спектра |
Рассеивание |
Вязкость, Пуаз |
|
АНС, водно-спиртовой раствор |
– |
425 |
85 |
0,01 |
– |
|
АНС + хитозан – уксусная кислота |
350 |
440 |
85 |
0,18 |
2,17 |
|
АНС + хитозан – лимонная кислота |
350 |
450 |
95 |
0,17 |
2,08 |
|
АНС + хитозан – янтарная кислота |
350 |
445 |
85 |
0,24 |
1,8 |
|
АНС + хитозан – молочная кислота |
350 |
450 |
83 |
0,51 |
0,67 |
|
АНС + хитозан – уксусная кислота |
260 |
445 |
102 |
0,11 |
2,43 |
|
АНС + хитозан – лимонная кислота |
260 |
450 |
105 |
0,10 |
2,38 |
|
АНС + хитозан – янтарная кислота |
260 |
450 |
95 |
0,12 |
1,86 |
|
АНС + хитозан – молочная кислота |
260 |
455 |
95 |
0,24 |
0,51 |
Рис. 3. Спектры флуоресценции АНС в хитозановых пленках, при формовании их из дисперсий в различных органических кислотах
Сдвиг максимума излучения в коротковолновую область по полученным графикам свидетельствует о том, что АНС практически полностью связался с молекулами хитозана. Установленный эффект впоследствии может быть использован при разработке методики детекции хитозана флуориметрическим способом.
Cпектры водно-спиртового раствора АНС, приведенные на рис. 2, получены с увеличением чувствительности прибора в 100 раз, следовательно, по полученным выше спектрам можно сделать вывод, что интенсивность флуоресценции в хитозановых композициях в 100 раз выше, чем интенсивность флуоресценции водно-спиртового раствора АНС, что свидетельствует о связывании АНС с молекулами хитозана. Молекулы красителя взаимодействуют с гидрофобными участками полимера. Неодинаковая интенсивность флуоресценции красителя в аналогичных хитозановых дисперсиях связана с различной молекулярной массой полимеров – образец I (Мм = 260 кДа), образец II (Мм = 350 кДа).
Соотношение спектральных характеристик полученных кислоторастворимых субстанций хитозана с его физико-химическими показателями представлено в таблице.
Установлено, что наиболее подходящим красителем для идентификации молекул хитозана спектральными методами является гидрофобный краситель 1-анили-8-нафталинсульфанат (АНС). Он перспективен для использования в качестве зонда в спектральных методах детекции хитозана.
В хитозановых пленках среда более полярна, чем в гелях, поэтому краситель АНС находится в более полярной фазе, что подтверждается сдвигом спектра в длинноволновую область с максимумом флуоресценции 470–480 нм (рис. 3).
Заключение
Изучены спектральные характеристики хитозановых субстанций, полученных с применением водных растворов органических кислот в диапазоне концентраций 2–4 %. Хитозановые субстанции получены в двух формах: дисперсии с массовой долей сухих веществ 2 % и плёнки. Ввиду того, что сам по себе хитозан не обладает флуоресцирующими свойствами, обоснован выбор гидрофобного красителя, способного максимально связываться с гидрофобными участками молекулы хитозана – АНС. Результаты исследования могут быть положены в основу для разработки методики качественного и количественного определения хитозана методом флуоресцентной спектрофометрии.
Рецензенты:
Кучменко Т.А., д.х.н., профессор, зав. кафедрой физической и аналитической химии, ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий», г. Воронеж;
Селеменев В.Ф., д.х.н., профессор, член Российской экологической академии, зав. кафедрой аналитической химии, ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет», г. Воронеж.