На сегодняшний день актуальным является изучение морфологических критериев, связанных с важнейшими клинико-морфологическими параметрами немелкоклеточного рака легкого (НМКРЛ), выживаемостью больных и способностью с большой долей вероятности прогнозировать течение заболевания. Пролиферация – основополагающий процесс в возникновении и развитии опухоли, а также фактор прогноза ее биологического поведения. На сегодняшний день существуют определенные трудности в достоверной оценке пролиферативного потенциала опухоли, так как пролиферация включает в себя не только количество пролиферирующих клеток (пролиферативная активность, фракция роста), но и скорость прохождения фаз клеточного цикла (продолжительность клеточного цикла).
Для оценки пролиферативной активности общепризнанным и доступным является иммуногистохимическое определение антигена Ki-67. Антиген Ki-67 выявляется в клетках в позднюю G1, S, G2, М фазы, однако функциональное значение этого ядерного белка в процессе пролиферации до конца не известно [1]. Аргирофильные белки, ассоциированные с ядрышкообразующими районами (Ag-ЯОР-белки), являются маркером скорости клеточного цикла. До 75 % окрашивания Ag-ЯОР-белков составляют два главных аргирофильных белка С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин), играющих важнейшую роль в синтезе рибосомальной РНК. Эти белки выявляются в ядрах клеток на протяжении всего клеточного цикла, количественно увеличиваясь в 1,5–3 раза в S- и G2-фазы [2]. Показана обратная зависимость между Ag-ЯОР-белками и длительностью клеточного цикла [3], временем удвоения НМКРЛ [4, 5].
Munakata S. и Hendricks J.B. предложили метод двойного окрашивания на антиген Ki-67 и Ag-ЯОР-белки, позволяющий оценивать активность ядрышковых организаторов (продолжительность клеточного цикла) в пролиферирующих клетках [6]. В мировой литературе работы, посвященные исследованию пролиферативного потенциала опухоли с использованием двойного окрашивания на антиген Ki-67 и Ag-ЯОР-белки, немногочисленны [7-13]. Отсутствуют работы, в которых результаты двойного окрашивания на антиген Ki-67 и Ag-ЯОР-белки оцениваются с использованием компьютерного анализа изображений и во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью при НМКРЛ.
Исходя из вышеизложенного целью работы стало исследование Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами и выживаемостью при НМКРЛ.
Материал и методы исследования
Исследованы 207 операционных материалов НМКРЛ, удаленных за период 2007–2009 гг. в Алтайском краевом онкологическом диспансере (случаи с М1 и множественными опухолями исключены из исследования). Средний возраст пациентов составил 59 лет (от 35 до 75 лет), 177 мужчин (86 %) и 30 женщин (14 %). Выполнена лобэктомия 145 пациентам (70 %) и пневмонэктомия 62 пациентам (30 %). Предоперационная химиотерапия и лучевая терапия не проводились. Постоперационная химиотерапия проведена 30 пациентам (14 %), чаще использовались цисплатин и этопозид. Постоперационная лучевая терапия проведена 64 пациентам (31 %), суммарной очаговой дозой 50–60 Гр. Патогистологическая характеристика опухолей определена согласно классификации TNM 7 пересмотра [14] и представлена в таблице.
Кусочки ткани фиксировали 18–24 часа в 10 % нейтральном забуференном формалине. После стандартной проводки операционного материала готовили гистологические срезы толщиной 4 мкм. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, ШИК-реактивом/альциановым синим, по Крейбергу. Для уточнения гистогенеза опухоли и с дифференциально-диагностической целью иммуногистохимическим методом определяли цитокератины 7 (клон SP52), 20 (клон SP33), High Molecular Weight (клон 34βE12), 5/6 (клон D5/16B4) в автоматическом стейнере Ventana XT (контроль окрашивания – эпидермис кожи и слизистая оболочка желудка).
Площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках при НМКРЛ.
|
Характеристика |
Количество случаев (абс. (%)) |
Площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках (в мкм2) |
|
|
Ме (и.и.) |
p |
||
|
Первичная опухоль Т 1 Т 2-3 Наибольший размер < 3 см > 3 см Лимфатические узлы N 0 N 1-3 Стадия I II-III Гистогенез аденокарцинома плоскоклеточный рак Дифференцировка высокая умеренная-низкая |
55 (27) 152 (73) 87 (42) 120 (58) 132 (64) 75 (36) 107 (52) 100 (48) 94 (45) 113 (55) 52 (25) 155 (75) |
8,95 (7,60–10,91) 11,08 (8,92–13,16) 8,93 (7,60–10,92) 11,60 (9,37–13,42) 9,43 (8,04–11,88) 11,89 (10,37–14,23) 9,35 (7,89–11,87) 11,41 (9,21–13,75) 10,20 (8,79–12,53) 10,58 (8,37–12,69) 8,79 (7,73–10,95) 11,01 (8,97–13,04) |
< 0,001 < 0,001 < 0,001 < 0,001 0,8 < 0,001 |
Из парафиновых блоков забраны столбики ткани иглой-панчером с внутренним диаметром 1,5 мм, на основании просмотра соответствующих гистологических препаратов. Для исключения гетерогенности окрашивания изготовлена тканевая матрица, с которой приготовлены гистологические срезы толщиной 4 мкм. Тканевая матрица окрашена иммуногистохимическим методом, согласно протоколу производителя: стрептавидин-биотиновым методом с первичными антителами к Ki-67 (клон MIB-1, DAKO) и хромогеном – new fuchsin. Перед окрашиванием срезы автоклавировали при 120 °С 20 минут, в 0,01 М цитратном буфере (рН = 6,0). После инкубации с хромогеном срезы отмывали в бидистиллированной воде. Далее срезы окрашивали азотнокислым серебром по одностадийной методике [6, 15]: во влажной камере при 37 °С 19 минут. Докрашивание ядер не проводили, срезы заключали в водную среду Faramount (DAKO). В каждом случае определяли площадь Ag-ЯОР-белков (в мкм2) в ядрах 100 случайно выбранных MIB-1 позитивных клеток с 10–30 цифровых изображений, полученных с соответствующих полей зрения микроскопа при увеличении х1000 (объектив х100, 1.25, oil). Компьютерный анализ изображений проводили в программе ImageJ 1.42. Для исключения ошибки измерений гранулы размером менее 0,1 мкм² исключены из анализа.
Статистический анализ данных осуществляли в программе Statistica 6.0. Так как полученные данные в выборках не соответствовали критериям нормального распределения, то меру центральной тенденции в группах представляли в виде медианы (Ме), а меру рассеяния в виде интерквартильного интервала (и.и.). При проверке статистических гипотез применяли непараметрические методы: однофакторный тест Краскела – Уоллиса, U-тест Манна – Уитни, для определения корреляции – χ2 тест. Определяли общую скорректированную выживаемость больных за пятилетний период после операции, использовали метод Каплана – Мейера, логарифмический ранговый тест, регрессионную модель Кокса. Достоверность полученных критериев оценивали при р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Результат иммуногистохимического окрашивания срезов с первичными антителами MIB-1 и последующей окраской азотнокислым серебром определялся в виде округлых гранул черного цвета (Ag-ЯОР-белки), расположенных на фоне красного ядра (в MIB-1 позитивных клетках) или на фоне коричневого ядрышка или бледно-желтого ядра (в MIB-1 негативных клетках) (рис. 1). Результаты определения Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках НМКРЛ во взаимосвязи с морфологическими параметрами опухоли, а также результаты сравнения между этими группами представлены в таблице.
Рис. 1. Аргирофильные белки, ассоциированные с ядрышкообразующими районами (Ag-ЯОР-белки) в MIB-1 позитивных и негативных клетках немелкоклеточного рака легкого: в плоскоклеточном раке с отсутствием (а) и наличием (б) метастазов в лимфатические узлы, в аденокарциноме с высокой (в) и низкой (г) дифференцировкой. Двойная окраска на Ki-67 (клон MIB-1) методом иммуногистохимии и на Ag-ЯОР-белки азотнокислым серебром, х1000
В НМКРЛ площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках составила 10,47 (8,57–12,69) мкм². Отмечалось увеличение площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках в группе Т2-3 по сравнению с Т1. При размере первичной опухоли менее 3 см площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках была меньше, чем в опухоли более 3 см. Найдено увеличение площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках НМКРЛ с наличием метастазов в лимфатические узлы по сравнению с опухолью без метастазов (рис. 1 а, б). Площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках меньше в I стадию заболевания по сравнению с II–III стадиями. Отсутствовало отличие площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках между аденокарциномой и плоскоклеточным раком. Площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках больше при умеренной и низкой дифференцировке по сравнению с высокодифференцированной карциномой (рис. 1 в, г). В НМКРЛ площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках имела корреляцию с показателем Т (р < 0,001), наибольшим размером опухоли (р < 0,001), показателем N (р < 0,001), стадией заболевания (р < 0,001) и дифференцировкой (р < 0,001).
Рис. 2. График выживаемости по Каплану – Мейеру больных немелкоклеточным раком легкого с небольшой (сплошная линия) и большой (прерывистая линия) площадью Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках. По оси абсцисс – время жизни (в днях), по оси ординат – доля выживших больных
Случаи с площадью Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках 10,47 мкм² и более считались с большой площадью (101 случай – 49 %), до 10,47 мкм² – с небольшой (106 случаев – 51 %). Общая скорректированная выживаемость больных НМКРЛ за пятилетний период после операции составила 39,3 ± 3,8 %. Выживаемость больных НМКРЛ имела статистически значимое отличие (р < 0,001) в зависимости от площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках: 61,2 ± 5,4 % – при небольшой площади и 16,2 ± 4,2 % – при большой (рис. 2). При однофакторном регрессионном анализе площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках НМКРЛ имела влияние на выживаемость больных (χ2 = 59,9, β = 1,51, стандартная ошибка 0,21, р < 0,001). При проведении многофакторного регрессионного анализа (χ2 = 60,3) влияние на выживаемость больных имели площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках (β = 1,05, стандартная ошибка 0,23, р < 0,001), наибольший размер опухоли (β = 0,90, стандартная ошибка 0,33, р = 0,007), показатель N (β = 0,81, стандартная ошибка 0,33, р = 0,01) и гистогенез НМКРЛ (β = 0,22, стандартная ошибка 0,10, р = 0,03).
В нашем исследовании НМКРЛ найдена взаимосвязь площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках с клинико-морфологическими параметрами по системе TNM: показателем Т, наибольшим размером опухоли, показателем N, стадией заболевания и дифференцировкой опухоли. В других исследованиях также показана взаимосвязь отдельных клинико-морфологических параметров по системе TNM с Ag-ЯОР-белками в MIB-1 позитивных клетках. Yamaguchi S. при НМКРЛ нашел увеличение количества Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках при Т4 по сравнению с Т1-3 и при N 2, 3 по сравнению с N 0, 1 [13]. Kidogawa H. с соавторами при раке молочной железы нашли увеличение количества Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках в опухоли с наибольшим размером более 2 см по сравнению с опухолью менее 2 см [10]. Tomobe M. с соавторами при раке мочевого пузыря нашли последовательное увеличение количества Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках в группах Т1, Т2, Т3 [12]. Однако, результаты в этих работах получены при субъективном анализе (визуальном подсчете количества Ag-ЯОР-белков) в отличие от наших результатов, полученных при объективном анализе (компьютерном программном анализе изображений).
Выживаемость больных НМКРЛ с небольшой площадью Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках лучше по сравнению с большой. При проведении одно- и многофакторного регрессионного анализа площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках имела независимое влияние на выживаемость больных НМКРЛ. Результаты, аналогичные нашим, получены при исследовании НМКРЛ [9], рака молочной железы [7, 8, 10, 11] и мочевого пузыря [12]. Многочисленные исследования Ag-ЯОР-белков в злокачественных опухолях указывают, что содержание Ag-ЯОР-белков – независимый фактор прогноза [16]. Прогностическая значимость содержания Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках взаимосвязана с разными темпами пролиферации НМКРЛ: при большой площади Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках – короткий клеточный цикл пролиферирующих клеток и высокая скорость пролиферации и наоборот, при небольшой площади – длинный клеточный цикл пролиферирующих клеток и низкая скорость пролиферации.
Таким образом, площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках взаимосвязана с клинико-морфологическими параметрами по системе TNM и выживаемостью при НМКРЛ.
Выводы
1. В НМКРЛ площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках взаимосвязана с клинико-морфологическими параметрами по системе TNM: показателем Т, наибольшим размером опухоли, показателем N, стадией заболевания и дифференцировкой.
2. Выживаемость больных НМКРЛ с небольшой площадью Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках лучше по сравнению с большой.
3. Площадь Ag-ЯОР-белков в MIB-1 позитивных клетках – независимый фактор прогноза при НМКРЛ.
Рецензенты:
Лепилов А.В., д.м.н., профессор кафедры патологической анатомии с секционным курсом, ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет», г. Барнаул;
Талалаев С.В., д.м.н., профессор кафедры гистологии, ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет», г. Барнаул.