Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

В настоящее время для предотвращения и лечения гриппа наряду с вакцинацией как наиболее эффективным противоэпидемическим средством против данной инфекции применяются химиопрофилактика и химиотерапия. Для этих целей в клинической практике имеется широкий спектр иммуномодулирующих, патогенетических и симптоматических средств наряду с препаратами специфической противогриппозной терапии. Последние в основном представлены химическими соединениями двух групп, отличающихся по мишеням и механизму действия в жизненном цикле вируса гриппа. Препараты первой группы – римантадин и амантадин – блокируют белок М2 вируса гриппа, играющий роль ионного канала в вирусной мембране, препятствуя тем самым процессу расщепления гемагглютинина и слияния мембран вируса и лизосомальной вакуоли [14]. Препараты второй группы – озельтамивир, занамивир, перамивир и ланинамивир – направлены на ингибирование вирусной нейраминидазы – фермента, необходимого для почкования вирусных частиц [15]. Обе группы препаратов имеют свои недостатки. В отношении производных адамантана можно отметить сравнительно высокую токсичность и узкий спектр действия (активны только против гриппа А). По сравнению с ними для ингибиторов нейраминидазы характерны несколько меньшая клиническая эффективность и высокая стоимость синтеза, что делает эти препараты менее доступными для широкого использования. Кроме этого, существенным недостатком для препаратов обеих групп является формирование резистентных вариантов вируса.

Поэтому поиск и внедрение в клиническую практику лекарственных средств для профилактики и лечения гриппа продолжает оставаться чрезвычайно актуальным.

В последнее десятилетие во многих странах мира наблюдается повышенный интерес к препаратам, в том числе и противовирусным, растительного происхождения, что обусловлено поливалентностью и мягкостью терапевтического действия биологически активных веществ (БАВ) растений, а также низкой токсичностью растительных препаратов, вследствие чего они могут применяться в течение длительного времени.

Известно, что биологическая активность лекарственных растений напрямую зависит от преимущественного содержания в них тех или иных действующих веществ, а также от комплекса сопутствующих соединений. Особый интерес представляют фенольные соединения, которые найдены почти во всех известных к настоящему времени высших растениях. Препараты на основе фенольных соединений обладают широким спектром биологической активности, в том числе антимикробной и противовирусной [11, 12].

Целью данной работы являлось изучение в культуре клеток и на лабораторных животных противовирусных свойств препарата, полученного на основе суммы флавоноидов из манжетки обыкновенной, в отношении вируса гриппа.

Материалы и методы исследования

В работе использовали водные растворы препаратов из надземных и подземных органов манжетки обыкновенной (Alchemilla vulgaris L.), собранной в фазу бутонизации – начала цветения на Семинском перевале Горного Алтая в 1997 году.

Препараты 5 и 6 получали из подземных органов манжетки путем извлечения 50-кратным объемом этилацетата, как описано в [1].

Препарат 7(1) был получен путем этанольного извлечения из сырой массы надземной части манжетки, как описано в [5].

Наряду с препаратами 5, 6, 7(1) были проведены испытания сухого экстракта 7(2) из надземной части манжетки, собранной в Кемеровской области в 2012 году. Этот экстракт был получен из сухой измельченной травы методом четырехкратной дробной мацерации 70 %-м этиловым спиртом при температуре 60 °С при соотношении сырья к экстрагенту 1:50 (общее время экстракции – 4 ч.). Охлажденный этанольный экстракт фильтровали, упаривали и высушивали при температуре 60 °С.

Качественный анализ образцов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на ВЭЖХ-системе, состоящей из жидкостного хроматографа «Agilent-1200» с диодноматричным детектором и системы сбора и обработки данных ChemStation. Для разделения использовали колонку Zorbax SB-C18, размером 4,6×150 мм, с диаметром частиц 5 мкм, применив градиентный режим элюирования. В подвижной фазе содержание метанола в водном растворе ортофосфорной кислоты (0,1 %) изменялось от 50 до 52 % за 56 мин. Скорость потока элюента 1 мкл/мин. Температура колонки 26 °С. Объем вводимой пробы 5 мкл. Детектирование осуществляли при λ = 360 нм. Для приготовления подвижных фаз использовали метиловый спирт (ос. ч) и бидистиллированную воду. Растворы стандартных образцов готовили в концентрации 10 мкг/мл в этиловом спирте. Состав фенольных соединений определяли, сопоставляя времена удерживания пиков веществ и спектральных данных. Проводили сравнение с литературными данными.

Количественное определение флавонолов проводили по методике В.В. Беликова и М.С. Шрайбер [3], в которой использована реакция комплексообразования флавонолов с хлоридом алюминия. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре СФ-26 при λ = 415 нм. Концентрацию флавонолов находили по калибровочному графику, построенному по рутину.

Содержание катехинов определяли спектрофотометрическим методом. Использовали способность катехинов давать малиновое окрашивание с раствором ванилина в концентрированной соляной кислоте. Плотность раствора измеряли на спектрофотометре СФ-26 при λ = 504 нм. Пересчетный коэффициент рассчитан по (+) – катехину «Sigma» [6].

Для определения танинов применяли реакцию с 2 %-м водным раствором аммония молибденовокислого. Интенсивность образовавшейся окраски измеряли на спектрофотометре СФ-26 при λ = 420 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Расчет танинов производили по государственному стандартному образцу (ГСО) танина [9].

Определение токсичности (максимально переносимых концентраций – МПК и 50 % токсических концентраций – TC50) этанольных и этилацетатных извлечений манжетки обыкновенной проводили на клетках MDCK, полученной из Коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», как описано нами ранее [7].

Определение антивирусной активности растительных экстрактов проводили в культуре клеток MDCK и на аутбредных мышах популяции ICR массой 14–16 г, полученных из Питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», в отношении вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и адаптированного к лабораторным мышам вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2), полученных из Коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Мышей подвергали эвтаназии в соответствии с требованиями по гуманному содержанию и использованию животных в экспериментальных исследованиях [8].

В экспериментах in vitro антивирусную активность экстрактов определяли по их способности ингибировать продукцию вируса гриппа зараженными клетками в сравнении с контрольной инфицированной культурой (без экстракта). Для этого на клеточный монослой MDCK вносили образцы экстрактов в разных концентрациях в момент их заражения вирусом (множественность заражения составляла 0,01 ТЦД50/кл.). Через 48 ч после заражения клеток вирусом гриппа и обработки их образцами растительных экстрактов брали пробы культуральной жидкости, в которых определяли титры вируса гриппа на клетках MDCK [7], рассчитывали и выражали их в lg ТЦД50/мл (десятичных логарифмах 50 %-х тканевых цитопатических доз в мл) по методу Рида и Менча [13]. Затем высчитывали индекс подавления репродукции (ИПР) вируса под влиянием экстрактов:

ИПР = Титр вируса_{контроль} – Титр вируса_опыт (lg) [7].

Кроме этого, в культуре клеток были определены 50 % эффективные дозы (IC50) и индексы селективности (SI) экстрактов, как представлено в [7].

В опытах по изучению протективных свойств растительных препаратов в отношении вируса гриппа А использовали профилактическую схему: препараты вводили перорально мышам (по 200 мкл/мышь) за час до заражения вирусом гриппа А/H3N2 или A/H5N1 в дозе 10 ЛД50 (50 %-х летальных доз in vivo) (ЛД50 определяли, как описано в [2]), далее препараты вводили 2 раза в сутки в течение 5 суток. За животными наблюдали в течение 14 суток. Высчитывали процент выживаемости животных в опыте и контроле и коэффициент защиты (КЗ) мышей. КЗ высчитывали по формуле

% гибели мышей в контроле – % гибели мышей в опыте.

При определении средней продолжительности жизни (СПЖ) в каждой группе учитывали число мышей, проживших определенное количество дней после заражения до гибели, и число выживших животных. За максимальный срок жизни выживших животных принимали 14 сут.

Статистическую обработку проводили стандартными методами с помощью пакета прикладных компьютерных программ «Statistica 6,0» [4, 10]. Сравнение титров вируса в контроле и опыте проводили по t-критерию Стьюдента, сравнение коэффициента защиты мышей в инфицированных группах под действием препарата манжетки проводили по Chi-square критерию, а СПЖ животных – по U-критерию Манна – Уитни [4, 10].

Результаты исследования и их обсуждение

Приводим краткую характеристику препаратов, полученных из надземных и подземных органов растений манжетки обыкновенной.

Препараты № 5 и 6, выделенные из подземных органов манжетки обыкновенной, представляют собой порошок розоватого цвета, состоящий в основном из катехинов и лейкоантоцианов (70 %). Методом ВЭЖХ в препарате № 5 идентифицированы (+) – катехин и галловая кислота, в препарате № 6 – (+) – катехин.

Препарат № 7(1) из надземных органов манжетки – это порошок желто-зеленого цвета, состоящий из суммы флавоноидов (71 %). Обнаружено не менее 30 соединений, из которых идентифицированы рутин, авикулярин, кверцетин, кемпферол и (–) – катехин.

Препарат № 7(2) представляет собой сухой экстракт коричневого цвета, в составе которого содержится не менее 21 соединения. Идентифицированы авикулярин, (+) – катехин, галловая, гентизиновая, феруловая кислоты и кумарин эскулетин.

Исследование токсичности экстрактов, полученных из корней (образцы № 5 и 6) и надземной части (образцы № 7(1) и 7(2)) растения, показало, что все препараты малотоксичны для клеток MDCK, максимально переносимые концентрации (МПК) на этих клетках для всех экстрактов составили 250 мкг/мл.

При исследовании ингибирования репродукции вируса гриппа в клетках MDCK препаратами из манжетки по профилактической схеме было показано, что препараты № 5 и 6, полученные из корней растения, по сравнению с образцами № 7(1) и 7(2) из его надземных органов в отношении вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) проявили более выраженный антивирусный эффект (ИПР вируса гриппа H3N2 под действием препаратов № 5 и 6 составили 2,0 и 1,95 lg соответственно, тогда как под действием препарата № 7(1) и экстракта № 7(2) – только 1,5 и 1,0 lg соответственно). В отношении другого штамма – А/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) так же, как и в отношении A/Aichi/2/68, все исследуемые препараты, полученные как из корней, так и из надземной части манжетки с использованием технологии очистки и концентрирования флавоноидных компонентов, обнаружили более выраженную антивирусную активность по сравнению с таковой для экстракта № 7(2) (ИПР вируса гриппа H5N1 под действием образцов № 5, 6 и 7(1) составили 4,0 lg, а под действием экстракта № 7(2) – 2,5 lg) (табл. 1).

В дальнейших исследованиях были определены TC50 и IC50 препаратов из манжетки в отношении используемых штаммов вируса гриппа и SI, представляющие собой отношение TC50 к IC50 (табл. 2). Как видно из таблицы, все растительные образцы подавляют размножение вируса гриппа А/H3N2 в клетках MDCK. Значения IC50 составляли 7,0; 14,0; 20,0 и 23,0 мкг/мл, а SI – 71,4; 35,7; 22,5 и 15,2 для образцов № 5, 6, 7(1) и 7(2) соответственно (табл. 2). Оценка эффективности этих же образцов в отношении вируса гриппа A/H5N1 показала, что значения IC50 для них были ниже по сравнению со значениями данного показателя в отношении вируса гриппа A/H3N2 и составляли 5,0; 10,0; 15,0 и 35,0 мкг/мл для образцов № 5, 6, 7(1) и 7(2) соответственно, при этом SI были выше и составляли 100,0; 50,0 30,0 и 10,0 соответственно, что говорит о низкой токсичности этих препаратов для клеток MDCK.

Таблица 1

Противовирусный эффект препаратов на основе суммы флавоноидов из различных органов манжетки обыкновенной (Alchemilla vulgaris L.) в культуре клеток MDCK

Примечания: *, # – достоверное отличие от соответствующего контроля (без экстракта) по t-критерию Стьюдента при p ≤ 0,05; М – среднее, m – ошибка среднего; n – число повторов.

Таблица 2

Антивирусный эффект препаратов на основе суммы флавоноидов из различных органов Alchemilla vulgaris L. в культуре клеток MDCK в отношении вируса гриппа

Таблица 3

Протективные свойства препаратов на основе суммы флавоноидов из различных органов Alchemilla vulgaris L. в отношении вируса гриппа в опытах на мышах

Примечания: КЗ – коэффициент защиты; СПЖ – средняя продолжительность жизни, М – среднее, Sm – стандартное отклонение; #отличие от контроля при р ≤ 0,05 по Chi-square критерию; *отличие от контроля при р ≤ 0,05 по U-критерию Манна – Уитни, n – число мышей в группе.

В опытах по изучению протективных свойств препаратов в отношении вируса гриппа установлено, что введение мышам образцов № 5, 6, 7(1) и 7(2) до заражения вирусом гриппа A/Aichi/2/68 и после заражения в течение 5 суток вызывало их значительную защиту (выживаемость животных составила 80,0; 60,0; 44,4 и 36,4 % соответственно) (табл. 3).

В инфицированных группах сравнения (введение Тамифлю) и контрольной группе (без препарата) выжило 100 и 22,2 % животных соответственно. В аналогичных исследованиях с вирусом гриппа А/chiken/Kurgan/05/2005 установлено, что введение мышам образцов № 5, 6, 7(1) и 7(2) и препарата сравнения Тамифлю защищало от гибели 44,4; 33,3; 16,7; 13,3 и 50,0 % животных соответственно при 100 % гибели мышей в контроле. Следует отметить, что препарат № 5, полученный из корней растения, проявил наибольшую защиту мышей от гибели при инфицировании их одним из двух используемых штаммов вируса гриппа (КЗ относительно A/H5N1 и A/H3N2 составил 44,4 и 57,8 % соответственно) (табл. 3).

Заключение

Препараты на основе Alchemilla vulgaris L. проявляют выраженную антигриппозную активность в культуре клеток MDCK и в модели на лабораторных мышах, в связи с чем они могут быть использованы для создания новых эффективных противовирусных препаратов против данной инфекции.

Рецензенты:

Белявская В.А., д.б.н., профессор, заведующая сектором отдела научно-методической подготовки персонала по работе с возбудителями особо опасных инфекций, ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», п. Кольцово;

Лебедев Л.Р., д.м.н., заведующий лабораторией нуклеиновых кислот и рекомбинантных белков, Институт медицинской биотехнологии, ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», г. Бердск.