Печень, играя ведущую роль в пластических и энергетических процессах организма, включается в адаптивно-компенсаторные реакции при всех экзогенных и эндогенных неблагоприятных воздействиях, даже в тех случаях, когда повреждающие факторы не обладают прямым гепатотропным эффектом [5, 7–11]. Значительное число исследований направлено на выявление и изучение структурных и метаболических проявлений повреждений печени, а также регенераторных процессов в этом органе при различных токсических воздействиях [1, 2, 4, 6]. Однако структурно-функциональные перестройки печени при действии контрастных температурных факторов изучены в недостаточной степени. Морфогенетические процессы, протекающие в ходе как нормального развития, так и при действии экстремальных факторов среды, характеризуются определенными пространственно организованными событиями в тканевых и клеточных системах [3, 12]. Архитектоника тканей и клеток отражает оптимальную для конкретных условий существования пространственную организацию функций, которая, наряду с такими процессами, как пролиферация, дифференцировка, созревание, гипертрофия, определяет особенности регенерации и компенсаторно-приспособительных реакций тканей и клеток. В этом аспекте оценка закономерностей пространственной реорганизации тканевых и клеточных систем имеет большое значение для выяснения регенераторных и адаптивных стратегий, а также направленности морфогенетических процессов.
Цель исследования – изучить общие закономерности и особенности структурной реорганизации печени при действии на организм контрастных температур на тканевом уровне.
Материал и методы исследования
Комплексный морфологический анализ печени экспериментальных животных проводили при контрастных температурных воздействиях – общем охлаждении и однократном общем перегревании организма. Эксперимент проведен с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации, а также в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985), одобрено этическим комитетом ФГБНУ ИМППМ.
В первую экспериментальную группу (умеренное охлаждение, 3–4 °С) входило 66 крыс-самцов линии Вистар в возрасте 5 мес. (из них 23 животных – контроль). Животных содержали в индивидуальных клетках без ограничения доступа к воде и пище в течение 6 и 8 нед, после чего декапитировали. Во вторую экспериментальную группу (чрезмерное охлаждение, –7 °С) входило 66 крыс-самцов линии Вистар в возрасте 4 мес. (из них 22 животных – контроль). Животных содержали в термальной камере в индивидуальных клетках постоянно, исключая время кормления. Время пребывания в термальной камере при выбранном режиме охлаждения определялось выживаемостью животных – массовая гибель животных наблюдалась после 16 сут. Исходя из этого длительность экспозиции составила 8 и 16 сут.
Воздействие однократного общего перегревания (42–43 °С) изучали на 36 крысах-самцах линии Вистар в возрасте 2 мес. (из них 9 животных – контроль). Время экспозиции животных в термальной камере (45 мин) определялось выживаемостью и соответствовало предельному сроку, после которого отмечалась их массовая гибель. Забор материала для морфологического исследования осуществляли сразу после перегревания, на 3-и, 7-е и 14-е сутки. Контрольных животных во всех сериях экспериментов содержали в обычных условиях вивария на стандартном лабораторном корме и при свободном доступе к воде.
Животных декапитировали в первой половине дня, производили макроскопическое обследование внутренних органов. Образцы печени фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина при комнатной температуре не менее 2 сут. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином с постановкой реакции Перлса, по методу ван Гизона с докраской эластических волокон резорцин-фуксином Вейгерта, ставили PAS-реакцию; полутонкие (1 мкм) срезы окрашивали 1 % раствором азура II.
Стереологический анализ проводили с помощью метода, основанного на подсчете числа точек тестовой системы, попавших на профиль исследуемой структуры, и числа пересечений тестовой линии с границами этой структуры, анализируя неперекрывающиеся поля зрения при увеличении 1320. Вычисляли относительные и абсолютные стереологические параметры: объемную плотность (относительный объем) гепатоцитов и их ядер, синусоидов, эндотелиальных клеток, клеток соединительной ткани без их дифференциации и суммарно основного вещества и волокон соединительной ткани; поверхностную плотность (относительную площадь поверхности) гепатоцитов и их ядер, синусоидных капилляров, клеток соединительной ткани. На основании первичных стереологических параметров рассчитывали вторичные, описывающие количественные взаимоотношения между компонентами стромы и паренхимы: поверхностно-объемное отношение структур, объемное отношение стромы к паренхиме, объемное и поверхностно-объемное отношение синусоидов к гепатоцитам.
Статистическая обработка результатов включала нахождение средних значений изучаемых параметров, вычисление дисперсии и ошибок средних (t-критерий Стьюдента).
Результаты исследования и их обсуждение
Общее охлаждение организма. Контрастные температурные воздействия вызывали различную направленность в изменениях массы тела и массы печени животных. Чрезмерное охлаждение в течение 16 сут и умеренное охлаждение в течение 6 нед привело к увеличению относительной массы печени на 12 и 22 % (р < 0,05) соответственно. При чрезмерном охлаждении увеличение относительной массы печени происходило за счет снижения массы тела животных (на 16 %, р < 0,05), а при умеренном охлаждении – за счет увеличения массы печени (на 24 %, р < 0,01). При воздействии высоких температур существенных изменений абсолютной и относительной массы печени не наблюдалось.
Тканевые изменения печени при общем умеренном и чрезмерном охлаждении носили стереотипный характер: на фоне нарушений гемодинамики развивались повреждения гепатоцитов, обусловившие мозаичность окрашивания паренхимы печени кислыми красителями. При умеренном общем охлаждении при сохранении общего строения печени отмечалось увеличение количества гепатоцитов с литическими повреждениями, со значительной разреженностью перинуклеарной зоны, пикнозом ядер. В гепатоцитах с нормальными тинкториальными свойствами отмечались выраженные полиморфизм и гипертрофия ядер гепатоцитов. Умеренное холодовое воздействие в течение 6 нед. привело к увеличению выработки липидов – обилие липидных капель в цитоплазме с преимущественным их накоплением на синусоидальных полюсах. К 8-й неделе эксперимента происходило существенное перераспределение липидов: в цитоплазме гепатоцитов их содержание существенно снижалось, а в клетках Ито – возрастало; нарастала интенсивность литических повреждений гепатоцитов, увеличивались размеры очагов некроза паренхимы, их диффузная мононуклеарная инфильтрация и мононуклеарная инфильтрация стромы и портальных трактов; сохранялся выраженный полиморфизм ядер гепатоцитов и их гипертрофия.
При чрезмерном охлаждении отмечалась аналогичная тенденция: на 8-е и 16-е сутки охлаждения отмечено выраженное увеличение размеров ядер и присутствие в ядрах липидных включений. К 16-м суткам выявлено усиление литических повреждений гепатоцитов, обширные некрозы паренхимы и формирование в очагах некроза мононуклеарных инфильтратов; усиление склеротических процессов. При чрезмерном общем охлаждении зарегистрированы более выраженные, чем при умеренном охлаждении, нарушения гемодинамики – полнокровие вен и синусоидов, отек стромы портальных трактов.
Изменения пространственной организации тканевого микрорайона печени при низких температурах носили в основном стереотипный характер. Зарегистрировано увеличение объемной и поверхностной плотности ядер гепатоцитов на 37 и 19 % (p < 0,05) через 6 нед. умеренного охлаждения и на 30 и 22 % через 8 сут чрезмерного охлаждения, что обусловило достоверное снижение их поверхностно-объемного отношения в обеих моделях (соответственно на 14 и 7 %) и свидетельствовало о гипертрофии и усилении функциональной активности ядер. При чрезмерном и умеренном охлаждении выявлены однонаправленные изменения ядерно-цитоплазматических отношений в гепатоцитах: происходило увеличение ядерно-цитоплазматического отношения на 6-й и 8-й неделе умеренного охлаждения на 32 и 14 % (p < 0,05) и на 8 и 16-е сутки чрезмерного охлаждения на 33 (p < 0,01) и 19 % (p < 0,05), соответственно. Важным моментом пространственной реорганизации тканевого микрорайона печени при умеренном общем охлаждении через 6 и 8 нед. эксперимента было уменьшение объемной (на 31 и 23 %) и поверхностной (на 24 и 10 %) плотности синусоидов. Это приводило к снижению объемного отношения синусоидов к гепатоцитам в эти сроки (на 35 и 26 %, p < 0,05) и уменьшению поверхностно-объемного отношения синусоидов к гепатоцитам (на 28 и 13 %). Особенностью умеренного охлаждения являлось снижение объемного отношения стромы к паренхиме на 6-й и на 8-й неделях эксперимента на 28 и 22 % (p < 0,05).
При чрезмерном общем охлаждении организма через 16 сут воздействия отмечено увеличение объемного (на 14 %), поверхностно-объемного (на 21 %, p < 0,05) отношения синусоидов к гепатоцитам и увеличение объемной плотности неклеточной компоненты соединительной ткани (на 43 %, p < 0,05). Такие изменения основных компонентов стромы обусловили увеличение (на 21 %) стромально-паренхиматозного отношения к 16-м суткам чрезмерного общего охлаждения.
Общее перегревание организма. Наиболее выраженные морфофункциональные изменения в печени крыс Вистар наблюдались на 3-и сутки после однократного общего перегревания – значительные изменения гемодинамики в виде полнокровия вен и синусоидных капилляров, на фоне которых развивались дистрофические и некробиотические повреждения гепатоцитов; усиление регенераторной активности отдельных гепатоцитов (появление двуядерных гепатоцитов в состоянии митоза с четко оформленным хроматином в виде жгутов, а также слияние ядер). На 7-е сутки происходило в основном восстановление гистологического строения печени, но оставались крупные очаги атрофированных гепатоцитов, окруженные мононуклеарными клетками; в строме портальных трактов и в очагах некроза происходило увеличение количества фибробластов. К 14-м суткам посттепловой реституции в перипортальной зоне происходило увеличение количества крупных очагов мононуклеарных инфильтратов, окружавших дегенерирующие гепатоциты; в строме портальных трактов и в очагах некроза фиксировалось большое количество фибробластов; регистрировалось усиление регенераторной активности двуядерных гепатоцитов (формирование хроматиновых нитей и сближение ядер).
Пространственная реорганизация тканевого микрорайона печени наиболее существенно изменялась на 3-и сутки после перегревания – происходило увеличение объемной плотности гепатоцитов на 5 % (р < 0,05) и снижение поверхностно-объемного отношения гепатоцитов на 16 % (р < 0,05), что свидетельствовало об увеличении их размеров (гипертрофии). Снижение объемной (на 8 %) и поверхностной (на 26 %, p < 0,05) плотности синусоидов и увеличение объемной плотности гепатоцитов в этот же срок обусловило уменьшение объемного (на 13 %, p < 0,05) и поверхностно-объемного (на 29 %, p < 0,05) отношения синусоидов к гепатоцитам. Уменьшение объемной плотности основных компонентов стромы – синусоидов, клеток, волокон и основного вещества соединительной ткани в этот же срок обусловило снижение объемного отношения стромы к паренхиме (соответственно на 23 и 18 %, р < 0,05). На 7-е сутки после перегревания было зафиксировано усиление процессов тканевой перестройки печени – снижение объемной (на 4 %, p < 0,05) и поверхностной (на 18 %, p < 0,05) плотности гепатоцитов, что было обусловлено усилением дистрофических и некробиотических процессов; увеличение объемной плотности синусоидов (на 20 %, p < 0,05), что приводило к увеличению объемного отношения синусоидов к гепатоцитам (на 24 %, p < 0,05).
Таким образом, проведенное исследование показало, что в печени животных под действием экстремальных экологических факторов (контрастных температурных воздействий) развиваются стереотипные морфофункциональные изменения: выраженные нарушения крово- и лимфообращения, дистрофия и некробиоз гепатоцитов с резорбцией их мононуклеарными клетками. Причем морфофункциональные изменения печени при общем охлаждении не вызваны снижением температуры тела, а обусловлены общим адаптационным синдромом и перераспределением пластических и энергетических ресурсов для достижения оптимального уровня теплопродукции [7, с. 10–12]. В результате усиления термогенеза и перераспределения пластических веществ при общем охлаждении организма в печени замедляются регенераторные процессы и постепенно снижается тканеспецифический белковый синтез, приводя к развитию дистрофических и некробиотических повреждений гепатоцитов и реактивным изменениям со стороны соединительной ткани. Общей закономерностью пространственной реорганизации печени на тканевом уровне при действии экстремальных экологических факторов является диспропорциональный характер изменений объемных и поверхностных плотностей основных тканевых компартментов, что приводит к «атипичной» регенерации, которая характеризуется нарушением тканевой архитектоники.
Рецензенты:
Селятицкая В.Г., д.б.н., профессор, заведующая лабораторией эндокринологии и заместитель директора по научной работе, ФГБНУ «НИИ экспериментальной и клинической медицины», г. Новосибирск;
Гуляева Л.Ф., д.б.н., профессор, заведующая лабораторией молекулярных механизмов канцерогенеза, ФГБНУ «НИИ молекулярной биологии и биофизики», г. Новосибирск.