По современным представлениям кишечный микробиоценоз во взаимосвязи с организмом хозяина рассматривается как своеобразный «экстракорпоральный орган», состоящий из огромного числа микроорганизмов, объединенных в единую экологическую систему «макроорганизм – микрофлора» [1, 3, 4, 6]. При этом кишечная микрофлора оперативно и постоянно реагирует на изменения в состоянии внутренней среды макроорганизма изменением своего качественного и количественного состава [2, 7, 8].
Ферменты играют основную роль в поддержании гомеостаза организма. Гомеостаз достигается сбалансированностью процессов инкреции ферментов с их экскрецией, связью с ингибиторами и протеолизом. При изменении нормальной жизнедеятельности организма возможно возрастание роли других путей перераспределения ферментов и изменение соотношения между ними [5], а качественные и количественные изменения состава микрофлоры в свою очередь сопровождаются сдвигами pH кишечного содержимого и другими изменениями химизма, которые препятствуют инактивации ферментов, что в результате приводит к изменению гомеостаза ферментативных систем.
Целью нашего исследования явилось установление взаимосвязей между активностью ферментов слюны и копрофильтрата как показателями функционального состояния пищеварительного тракта и микроэкологическими нарушениями толстого отдела кишечника у детей раннего возраста.
Материалы и методы исследования
Обследованы 43 ребенка раннего возраста (от 1 года до 3 лет) с анамнестически выявленными дезадаптирующими факторами развития микробиоценоза кишечника (рахит, гипотрофия и дерматит), воспитывающихся в детском дошкольном учреждении с 24-часовым пребыванием (Дом ребёнка). У обследованных был изучен микробиоценоз кишечника, выявленные нарушения корректировались пробиотическими препаратами. Анализ кала на дисбактериоз проводился дважды до и после коррекции дисбиотических изменений. Одновременно изучалась ферментативная активность (амилаза и щелочная фосфатаза) слюны и кала. Обследованные находились в условиях стандартного режима дня и рациона питания. Группу сравнения составили 25 практически здоровых детей раннего возраста (от 1 года до 3 лет), у которых отсутствовали желудочно-кишечные заболевания и анамнестически исключены дезадаптирующие факторы развития микробиоценоза кишечника (рахит, гипотрофия и дерматит), обследование которых осуществлялось однократно.
Кишечную микрофлору изучали в соответствии с требованиями ОСТа 91500.11.0004-2003. Количественное содержание основных представителей нормальной микрофлоры кишечника выражали в lg КОЕ/г. Для коррекции изменений биоценоза у детей были выбраны пробиотические препараты «Бифидофлорин», «Лактофлорин», «Бифидумбактерин» и «Аципол». Обследованные принимали препараты по назначению врача, согласно инструкции.
Активность α-амилазы определялась ферментативным колориметрическим тестом с использованием 4,6-этилиден (G7)-р-нитрофенилом (G1)-α,D-мальтогептозидом (этилиден – G7ПНФ) в качестве субстрата (реактив фирмы «Biocon»). Активность щелочной фосфатазы определяли колориметрическим тестом с использованием р-нитрофенилфосфата в качестве субстрата в глициновом буфере (Бессей, Лоури, Брок, 1946). Для определения был использован биохимический анализатор «Cobas Mira Plus» фирмы «Roche».
Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью статистического пакета Statistika 6.0. Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез принимался за 0,05. Проверка на нормальность распределения измеренных переменных проводилась по критерию Shapiro-Wilk. В случае нормального распределения переменных применялся параметрический метод по Стъюденту, при ненормальном распределении – непараметрический метод по Вилкоксону. Корреляционный анализ параметров проведен с учетом ранговой корреляции по Спирмену.
Результаты исследования и их обсуждение
При анализе микробиоценоза кишечника детей раннего возраста с анамнестически выявленными дезадаптирующими факторами развития микробиоценоза кишечника (рахит, гипотрофия и дерматит) отмечалось достоверное снижение титра лактобактерий 6,79 ± 0,2 lg (р < 0,05) и бифидобактерий 8,05 ± 0,17 lg (табл. 1).
Таблица 1
Состав микробиоценоза кишечника обследованных детей раннего возраста
|
Название и уровень м/о |
Группа сравнения (n = 25) |
Обследованные дети раннего возраста (n = 43) (первичное обследование) |
Обследованные дети раннего возраста (n = 43) (после пробиотической коррекции) |
|||
|
Процент обнаружения |
М ± m lg КОЕ/г |
Процент обнаружения |
М ± m lg КОЕ/г |
Процент обнаружения |
М ± m lg КОЕ/г |
|
|
Lactobacillus ≤ 106 |
8 |
7,56 ± 0,28** |
41,9 |
6,79 ± 0,2** |
– |
7,93 ± 0,04@ |
|
Bifidobacterium ≤ 107 |
32 |
7,96 ± 0,33 |
23,2 |
8,05 ± 0,17 |
– |
8,99 ± 0,004@ |
|
Escherichia coli ≤ 106 |
20 |
6,68 ± 0,14* |
60,5 |
5,35 ± 0,27* |
37,2 |
6,63 ± 0,83@ |
|
Escherichia coli (гемолизирующая) 20 % и более |
84* |
41,9* |
30,2@@ |
|||
|
Clostridium ≥ 105 |
84 |
5,8 ± 0,33* |
51,2 |
4,19 ± 0,29* |
9,3 |
2,93 ± 0,15@ |
|
Staphylococcus ≥ 103 |
16 |
0,6 ± 0,28 |
27,9 |
1,07 ± 0,27 |
– |
0,02 ± 0,02@ |
|
Enterococcus > 107 |
16 |
7,36 ± 0,17 |
4,6 |
7,05 ± 0,07 |
– |
7,01 ± 0,01 |
|
УПФ (Proteus, Citrobacter, Enterobacter и др.) > 104 |
72* |
30,2* |
6,97@ |
|||
Примечания: *p ≤ 0,01,** – p ≤ 0,05 – различия достоверны при сравнении результатов с группой сравнения; @p ≤ 0,01, @@ – p ≤ 0,05 – различия достоверны при сравнении результатов до и после пробиотической коррекции.
Отмечалось снижение титра нормальной Е. coli 5,35 ± 0,27 lg (р < 0,01), в 41,9 % случаев отмечался рост количества Е. coli с измененными ферментативными свойствами (гемолизирующая кишечная палочка) (р < 0,01). Также были обнаружены бактерии рода Clostridium 4,19 ± 0,29 lg (р < 0,01), чаще, чем у детей группы сравнения, встречались бактерии S. аureus 1,07 ± 0,27 lg, у 30,2 % обследованных были обнаружены высокие титры грамотрицательных представителей УПФ (Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Alcaligenеs и др.) (р < 0,01) (табл. 1). Обнаружение УПФ, вероятно, связано со снижением регуляторной функции бифидобактерий.
На фоне пробиотической коррекции было отмечено восстановление резидентной микрофлоры обследованных детей (табл. 1). Достоверно повышались титры лактобактерий 7,93 ± 0,04 lg (р < 0,01) и бифидобактерий 8,99 ± 0,004 lg (р < 0,01), что подтверждает гипотезу о физиологически целесообразном включении биокоррекции в собственные механизмы защиты организма. На фоне пробиотической коррекции содержание E. coli повышалось до возрастной нормы 6,63 ± 0,83 lg (р < 0,01), обнаружение Е. coli с измененными ферментативными свойствами (гемолизирующая кишечная палочка) резко уменьшилось и стало достоверно ниже исходного уровня – 30,2 % (р < 0,05). Данный факт указывает на позитивное воздействие пробиотиков не только на количественные характеристики E. coli, но и на функциональную активность кишечной палочки.
Одновременно констатировалось достоверное значительное снижение количества условно-патогенной микрофлоры за счёт элиминации бактерий рода Clostridium, их количество составляло в среднем 2,93 ± 0,15 lg (р < 0,01), и снижения титра S. aureus до 0,02 ± 0,02 lg (р < 0,01). Кроме того, у обследованных детей раннего возраста уменьшалась концентрация других представителей УПФ (Proteus, Citrobacter, Enterobacter и др.), так, достоверно наблюдалась полная их элиминация из фекалий у 23,2 % обследованных (р < 0,01) (табл. 1).
Амилолитическая активность слюны детей группы сравнения (n = 25) в пределах нормальных значений составляет 4767,0 ± 481,8 ед./л амилаза слюны, 13,6 ± 5,5 ед./л щелочная фосфатаза слюны. Уровень указанных ферментов в копрофильтрате 3380,0 ± 610,0 и 2606,5 ± 110,1 ед./л соответственно. Нами условно эти значения были приняты за показатели для сравнения с уровнем указанных ферментов у обследованных детей раннего возраста.
Активность амилазы слюны 22301,1 ± 1497,5 ед./л обследованных детей раннего возраста значительно выше (p ≤ 0,05) показателей детей группы сравнения. Щелочнофосфатазная активность слюны 12,4 ± 2,5 ед./л обследованных соответствовала показателям сравнения. Однако в копрофильтрате уровень энзима 14267,4 ± 2168,9 ед./л значительно превышал (p ≤ 0,05) соответствующие данные у детей группы сравнения. Уровень амилазы кала обследованных составил 13077,2 ± 2563,4 ед./л, что значительно выше показателей группы сравнения (табл. 2).
На фоне пробиотической коррекции биоценоза кишечника отмечалось сохранение повышенной экскреции ферментов слюнными железами и кишечником. Активность амилазы слюны оставалась достоверно высокой 18998,6 ± 1362,7 ед./л (p ≤ 0,05), при этом отмечено достоверное снижение щелочнофосфатазной активности слюны в пределах возрастных норм 9,4 ± 1,1 ед./л (p ≤ 0,05) (табл. 2). На фоне применения пробиотических препаратов при отсутствии динамики щелочнофосфатазной активности копрофильтрата 13905,2 ± 2355,7 ед./л, экскреция амилазы кишечником достоверно снижалась до 7657,0 ± 1440,9 ед./л (p ≤ 0,05) (табл. 2). Снижение экскреции кишечной амилазы на фоне пробиотической коррекции закономерно свидетельствует о расщеплении избытков данного фермента представителями нормальной микрофлоры кишечника и пробиотиков.
Щелочная фосфатаза является биохимическим маркером дисбактериоза, что подтверждено очень высокой её активностью (в 5 и более раз) у детей с нарушениями биоценоза. Данный факт является показателем недостаточного восстановления функциональной активности симбионтов и может служить критерием необходимости продления курса биокоррекции для закрепления результатов положительной динамики количественного и качественного восстановления микробиоценоза при пробиотической коррекции.
Изменение функционального состояния организма при нарушении кишечного биоценоза сопровождается коррелятивным увеличением активности ферментов слюны – амилазы и щелочной фосфатазы (r = 0,3, при р = 0,049), что может указывать на энергетическое обеспечение ферментными системами измененного метаболизма углеводов.
Обнаруженные внутрисистемные взаимосвязи микробного гомеостаза иллюстрируют дисбиотические нарушения функционирования системы. Корреляционное увеличение количества представителей условно-патогенной микрофлоры: клостридий и стафилококка (r = 0,34, при р = 0,026), клостридий и E.coli гемолизирующей (r = 0,52, при р = 0,000389), клостридий и УПФ (r = 0,397, при р = 0,008377), энтерококков и УПФ (r = 0,33, при р = 0,03) прежде всего связано со снижением антагонистических свойств представителей нормофлоры (рис. 1).
Несмотря на обособленность и стабильность бифидофлоры, обнаружены её корреляционные связи с бактериями рода Staphylococcus (r = 0,36, при р = 0,016) и обратная корреляция бифидофлоры и E. coli (r = –0,41, при р = 0,006), что указывает на некоторое напряжение в системе облигатной микрофлоры. Данные связи, по-видимому, характеризуют формирование глубоких нарушений кишечного микробиоценоза, что является следствием длительного воздействия неблагоприятных факторов.
Достоверной зависимости между показателями облигатной микрофлоры толстой кишки и уровнем ферментов слюны и копрофильтрата у детей раннего возраста с изменениями биоценоза кишечника не отмечалось. Следовательно, при изменении количественного и качественного состава нормоценоза происходит нарушение взаимозависимого функционирования ферментных систем слюны и копрофильтрата и микрофлоры кишечника.
Анализ корреляционных зависимостей между микроорганизмами на фоне пробиотической коррекции показал восстановление функционирования системы микробного гомеостаза. Отмечены достоверные обратные корреляционные связи представителей нормофлоры и условно-патогенной микрофлоры: бифидобактерий и клостридий (r = –0,41, при р = 0,006), лактобактерий и стафилококка (r = –0,45, при р = 0,0026). Данные связи характеризуют восстановление собственных защитных механизмов организма (рис. 2).
Таблица 2
Активность пищеварительных ферментов в слюне и копрофильтрате (ед./л) обследованных детей раннего возраста
|
Показатели |
Группа сравнения (n = 25) |
Обследованные дети раннего возраста (n = 43) (первичное обследование) |
Обследованные дети раннего возраста (n = 43) (после пробиотической корреккции) |
|
Слюна: Амилаза, Ед/л ЩФ, Ед/л |
4767,0 ± 481,8* 13,6 ± 5,5 |
22301,1 ± 1497,5* 12,4 ± 2,5 |
18998,6 ± 1362,7@@ 9,4 ± 1,1@@ |
|
Кал: Амилаза, Ед/л ЩФ, Ед/л |
3380,0 ± 610,0 2606,5 ± 110,1* |
13077,2 ± 2563,4 14267,4 ± 2168,9* |
7657,0 ± 1440,9@@ 13905,2 ± 2355,7 |
Примечания: * p ≤ 0,05 – различия достоверны при сравнении результатов с группой сравнения;
@p ≤ 0,01, @@ – p ≤ 0,05 – различия достоверны при сравнении результатов до и после пробиотической коррекции.
Рис. 1. Корреляционные взаимосвязи ферментативного спектра и микробиологических показателей (до пробиотической коррекции)
Рис. 2. Корреляционные взаимосвязи ферментативного спектра и микробиологических показателей (после пробиотической коррекции)
После пробиотической коррекции значительно изменилась структура и значимость корреляционных связей между пищеварительными ферментами и микроэкологией. Были отмечены обратные корреляционные зависимости между кишечными симбионтами и ферментами: щелочная фосфатаза кала и лактобактерии (r = –0,407, при р = 0,007), амилаза кала и бифидобактерии (r = –0,312, при р = 0,044), подобных связей не отмечалось до пробиотической коррекции. Восстановление нормального уровня бифидо- и лактобактерий приводит к уменьшению экскреции ферментов кишечником, что и подтверждается корреляционными взаимоотношениями.
Заключение
Таким образом, на фоне дисбиотических изменений происходит напряжение и рассогласование гомеостатических систем, что подтверждается наличием внутрисистемных связей между микроорганизмами и ферментами, но отсутствием межсистемных связей микроорганизмов и активности ферментов. Пробиотическая коррекция меняет структуру функционирования гомеостатических систем, что подтверждается наличием корреляционных связей.
Рецензенты:
Камакин Н.Ф., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой нормальной физиологии, Кировская государственная медицинская академия Минздрава России, г. Киров;
Спицин А.П., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой патофизиологии, Кировская государственная медицинская академия Минздрава России, г. Киров.