Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

DEVELOPMENT OF A METHOD FOR PCR-RFLP ON THE EXAMPLE OF DGAT1 GENE IN CATTLE

Tyulkin S.V. 1 Vafin R.R. 1 Muratova A.V. 2 Khatypov I.I. 3 Zagidullin L.R. 4 Rachkova E.N. 4 Akhmetov T.M. 4 Ravilov R.K. 4
1 Tatar trans-regional veterinarian laboratory
2 AMC Media LLS
3 Prosto moloko LLS
4 Kazan state academy of veterinary medicine
The aim of this work was to develop an efficient method for the detection of single nucleotide substitutions (SNP) and identification of allelic variants of genes based on PCR-RFLP analysis. We have developed and tested in the genotyping of cattle in the alleles A and K gene DGAT1 method PCR-RFLP different from the counterpart of the fact that at the stage of PCR in the production of «Single PCR» is used three primers, two of which are allelespecific, and the third primer is common to both alleles of the analyzed gene. Primers DGAT1-1 + DGAT1-2 + DGAT1-3 initiate amplification plot DGAT1 gene of cattle with a length of 100 bp, respectively DGAT1-RFLP-TaqI profile AA = 82/18 bp, КК = 100 bp and AK = 100/82/18 bp. Conducting RFLP analysis allowed to identify the genotypes and alleles of gene in corresponding RFLP-TaqI-profiles; his suggests that the proposed and tested a new method of PCR-RFLP effective and it can be used of identification for genotypes and alleles of other genes.
DNA
PCR-RFLP
primer
method
DGAT1 gene
allele
cattle
1. Zaripov O.G. Genotipirovanie krupnogo rogatogo skota po genam beta-laktoglobulina I kappa-kazeina metodami DNK-tekhnologii: diss. kand. biol. nauk. Kazan, 2010, pр. 30.
2. Zinnatova F.F., Zinnatov F.F. Rol genov lipidnogo obmena (DGAT1, TG5) v uluchshenii khozyastvenno-poleznykh priznakov krupnogo rogatogo skota // Uchenye zapiski Kazanskoi GAVM, 2014. T. 219. pp. 164–168.
3. Patent RF no. 2528743 S1, 20.09.2014.
4. Chikuni K. Identification of bovine kappa-casein genotypes using polymerase chain reaction method // J. Zootechn. Sci. 1991. no. 7. рр. 654–659.
5. Jacobson D. R., Moskovits T. Rapid, nonradioactive screening for activating ras oncogene mutations using PCR-primer introduced restriction analysis (PCR-PIRA) // PCR Methods Appl. 1991. Vol. 1. no. 2. рр. 146–148.
6. Komisarek J., Michalak A. A relationship between DGAT1 K232A polymporphism and selected reproductive traits in Polish Holstein-Friesian cattle // Anim. Sci. Pap. and Rep. 2008. Vol. 26. no. 2. рр. 89–95.
7. Velmala R., Mantysaari E.A., Maki-Tanila A. Molecular genetic polymorphism at the k-casein and B-lactoblobulin loci in Finish diary bulls // Ari. Sci. Finl. 1993. Vol. 2. рр. 431–435.

Наиболее удобным методом диагностики аллельного полиморфизма ряда генов отвечающих за хозяйственно полезные признаки сельскохозяйственных животных, является ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция с последующим анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов). Благодаря своей простоте и точности он получил широкое распространение в диагностических научно-исследовательских учреждениях [1]. Суть данного метода в том, что происходит амплификация участка определённого (исследуемого) гена, несущего сайт узнавания для эндонуклеазы, с последующим разрезанием его соответствующим ферментом. По длине образовавшихся фрагментов (ПДРФ) делают заключение о наличии / отсутствии искомых аллелей у индивидуума [4, 7].

Одним из важных генов липидного обмена у крупного рогатого скота является ген диацилглицерол О-ацилтрансферазы (DGAT1). Исследования, проведённые на коровах-первотёлках холмогорской породы татарстанского типа, продемонстрировали, что наилучшие показатели молочной продуктивности имели аналоги, несущие в своём геноме K-аллель гена DGAT1 [2]. В связи с этим исследования, касающиеся разработки методов изучения аллельного полиморфизма гена DGAT1, актуальны и представляют научный интерес.

Цель настоящей работы – разработка эффективного способа детекции единичных нуклеотидных замен (SNP) и идентификации аллельных вариантов генов на основе ПЦР-ПДРФ-анализа.

Материалы и методы исследования

Экстракция нуклеиновой кислоты из образцов цельной крови крупного рогатого скота, консервированной 10 мМ ЭДТА-Na2, осуществлялась сорбционным способом («ДНК-сорб B», ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).

Разработанный способ проведения ПЦР-ПДРФ апробирован на примере генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1.

Анализ локуса гена DGAT1 при проведении ПЦР-ПДРФ. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объёме 20 мкл, содержащей буфер (60 мМ трис-HCl (рН 8,5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэталол; 0,1 мМ тритон Х-100), 5 % DMSO, 0,25 мМ dNTP, 1 ед. Taq ДНК полимеразы, по 0,25 мкМ праймеров DGAT1-1: 5/-ccgcttgctcgtagctttcgaaggtaacgc-3/ и DGAT1-2: 5/-ccgcttgct cgtagctttggcaggtaacaa-3/, по 0,5 мкМ праймера DGAT1-3: 5/-AGGATCCTCACCGCGGTAGGTCAGG-3/ [3] для амплификации фрагмента гена DGAT1 длиной 100 пар нуклеотидов, 1 мкл пробы ДНК в следующем режиме:

×1: 94 °С – 4 мин; ×40: 94 °С – 10 с, 72 °С – 10 с;

×1: 72 °С – 5 мин.; хранение: 4 °С.

Для определения аллельного полиморфизма гена DGAT1 по вариантам А и К 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 20 ед. эндонуклеазы рестрикции TaqI в 1×буфере «Y» фирмы СибЭнзим (Россия) при 65 °C в течение ночи.

Детекцию результатов ПЦР-ПДРФ осуществляли методом горизонтального электрофореза в 3 % агарозном геле в буфере ТBE (рН 8,0), содержащем этидий бромида в концентрации 0,5 мкг/мл, с последующей визуализацией амплифицированных продуктов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (λ = 310 нм).

Размеры фрагментов ДНК оценивали по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами.

В работе были использованы продукты для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим», Россия.

Исследования по определению полиморфных вариантов гена DGAT1 у 70 чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей проводились в ГУП ГПП «Элита» Высокогорского района Республики Татарстан.

Результаты исследования и их обсуждение

Одним из подходов к детекции единичных нуклеотидных замен (SNP) и идентификации аллельных вариантов генов является способ ПЦР-ПДРФ (PCR-RFLP), включая её модификацию – PCR-PIRA (PCR-primer introduced restriction analysis), являющуюся ближайшим аналогом предлагаемого способа [5, 6].

Нами разработан и апробирован на примере генотипирования крупного рогатого скота по аллелям A и К гена DGAT1, схожий с прототипом [6], способ проведения ПЦР-ПДРФ, включающий подготовку пробы нуклеиновой кислоты, внесение указанной пробы в реакционную смесь для ПЦР, состоящую из деионизированной воды, дНТФ, буферной системы, Taq ДНК полимеразы, праймеров, проведение ПЦР, последующее эндонуклеазное расщепление ПЦР-продукта рестриктазой и детекцию полученных ПЦР-ПДРФ-фрагментов методом гель-электрофореза, отличающийся тем, что на этапе ПЦР в постановке «Single PCR» используются три олигонуклеотидных праймера, два из которых являются аллельспецифичными, но с заданным идентификационным сайтом рестрикции для одного из них, а третий праймер – общий для обеих аллелей анализируемого гена.

pic_86.tif

Рис. 1. Результаты выравнивания и TaqI-рестрикционного картирования амплифицируемых с помощью трёх праймеров DGAT1-1 + DGAT1-2 + DGAT1-3 нуклеотидных последовательностей ДНК локуса DGAT1-гена Bos Taurus (аллели А и К)

pic_87.tif

Рис. 2. Электрофореграмма результата TaqI-ПЦР-ПДРФ-идентификации аллелей А и К гена диацилглицерол О-ацилтрансферазы крупного рогатого скота с использованием трёх праймеров DGAT1-1 + DGAT1-2 + DGAT1-3 и рестриктазы TaqI. Обозначения: М) ДНК-маркеры 100 bp + 50 bp (СибЭнзим); 1–4, 6, 8–11, 13, 15, 17–18) TaqI-ПЦР-ПДРФ-профиль генотипа АК (100/82/18); 5, 16) TaqI-ПЦР-ПДРФ-профиль генотипа АА (82/18 bp); 7, 12, 14) TaqI-ПЦР-ПДРФ-профиль генотипа КК (100 bp)

Процесс валидации способа проведения ПЦР для идентификации аллельных вариантов DGAT1-гена крупного рогатого скота осуществляли с учётом анализа выравнивания фланкируемых тремя праймерами DGAT1-1 + DGAT1-2 + DGAT1-3 (рис. 1) и путём тестирования протокола ПЦР-ПДРФ (рис. 2).

Праймеры DGAT1-1 + DGAT1-2 + DGAT1-3 инициируют амплификацию участка DGAT1-гена крупного рогатого скота длиной 100 bp, соответственно DGAT1-ПДРФ-TaqI профиль АА = 82/18 bp, КК = 100 bp и АК = 100/82/18 bp.

После проведения ДНК-анализа 70 быков-производителей распределение животных по генотипам локуса гена DGAT1 было следующим: 38 (54,3 %) быков имели гомозиготный генотип АА; 28 (40,0 %) – гетерозиготный генотип АК и 4 (5,7 %) быка с гомозиготным генотипом КК. При этом частота аллеля А составила 0,74, а аллеля К – 0,26.

Вывод

По результатам практических исследований, направленных на апробацию разработанного нами способа проведения ПЦР-ПДРФ, нами получен обеспечиваемый заявленным способом технический результат, выраженный в эффективной идентификации генотипов (на примере генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1) ввиду корректной интерпретации генерируемых генотип-специфичных фрагментов.

Рецензенты:

Алимов А.М., д.вет.н., профессор кафедры биологической и неорганической химии, Казанская государственная академия ветеринарной медицины, г. Казань;

Софронов В.Г., д.вет.н., профессор кафедры зоогигиены, Казанская государственная академия ветеринарной медицины, г. Казань.

Работа поступила в редакцию 17.04.2015.