Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

В последнее время активно проводятся исследования по разработке терапевтических вакцин на основе рекомбинантных белков для лечения заболеваний, вызванных вирусом папилломы человека (ВПЧ). Одним из перспективных направлений в таких разработках считается использование в качестве иммунизирующего антигена раннего онкобелка Е7 ВПЧ, конъюгированного с полноразмерным белком теплового шока НSP 70 Mycobacterium tuberculosis [1]. Сочетание в одном комплексе Е7-HSP70 вирусного белка и антигена микобактерий, по данным многих исследователей, может приводить к активации различных звеньев врожденного и приобретенного иммунитета [8, 9]. Несмотря на активные исследования в области создания эффективных препаратов против ВПЧ, данные о ключевых механизмах иммунной защиты от инфекции и элиминации вируса из организма крайне противоречивы, что во многом объясняется отсутствием адекватных биологических моделей для изучения отдельных звеньев иммунного ответа [5, 7].

Как известно, белки теплового шока микобактерий являются сильным иммуногеном и способны активировать обе ветви специфического иммунитета – и клеточного, и гуморального. В отношении вирусного антигена Е7 в последнее время появляется все больше экспериментальных данных по активации иммунного ответа через цитоксические лимфоциты CD8(+). Однако многие исследователи приводят данные по стимуляции Е7 также Т-лимфоцитов фенотипа CD4(+), Т-хелперов 1 типа, натуральных киллеров [5].

Таким образом, в отсутствие эффективной биологической модели оценка количества различных субпопуляций Т-лимфоцитов и содержания интерферона-гамма, как ключевого цитокина Т-хелперов 1 типа -зависимых иммунных реакций, позволит дать первичную оценку механизмов иммунного ответа на новую вакцину против ВПЧ-ассоциированных заболеваний и специфицировать его иммуногенность, что является обязательным этапом контроля качества иммунобиологического лекарственного средства [5, 6].

Цель исследования: изучить динамику показателей клеточного иммунитета у мышей-самцов линии С57BL/6 при однократном внутримышечном введении терапевтической вакцины против рецидивирующего респираторного папилломатоза и аногенитального кондиломатоза.

Материалы и методы исследования

Изучено действие терапевтической вакцины, состоящей из двух гибридных рекомбинантных белков на основе антигена Е7 вируса папилломы человека (ВПЧ) 6 или 11 типа, конъюгированных с полноразмерным белком теплового шока НSP 70 Mycobacterium tuberculosis [1]. Белки сорбированы на алюминия гидроксиде. Готовая форма не содержит консервантов и антибиотиков. Одна доза (0,5 мл) содержит по 100 мкг гибридных рекомбинантных белков. Исследованы 3 опытно-промышленные серии препарата, предварительно охарактеризованные по основным параметрам качества [2–4].

Исследования на животных проводили в полном соответствии с этическими принципами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.).

Эксперименты выполнены на клинически здоровых половозрелых мышах-самцах линии С57BL/6 в возрасте от 2,5 до 3 месяцев, с массой тела 20,0 ± 2,0 г на начало исследования, находившихся в одинаковых условиях содержания и кормления. Животные получены из филиала «Андреевка» НЦБМТ РАМН.

При выборе доз руководствовались средней терапевтической дозой, в которой изучаемый препарат планируется для клинического применения. Пересчет доз с человека на животных осуществляли методом эквитерапевтических доз с учетом коэффициента поверхности тела. Животным опытной группы вводили исследуемый препарат в дозе 0,084 мл/кг в 0,5 мл стерильного буферного раствора готовой лекарственной формы однократно внутримышечно (проведено три серии экспериментов в идентичных дозах). Животным контрольной группы вводили стерильный буферный раствор готовой лекарственной формы в объеме 0,5 мл.

Забор селезенки и периферической крови (0,3–0,5 мл) проводился на 7, 14, 21 и 28 сутки после однократного введения препарата. Животных выводили из эксперимента помещением в СО2-камеру и последующим обескровливанием методом декапитации. Количество выводимых на каждом из указанных этапов животных в опытной и контрольной группах равнялось 10.

Выделенную селезенку гомогенизировали на приборе (гомогенизатор TYPE 32, Польша) с 5 мл среды RPMY 1640 (Sigma, R5886, США) при 4 °С. Полученную суспензию клеток пропускали через пористые фильтры с диаметром пор 100 микрон (Becton Dickinson, США) методом самотека. Пробоподготовку клеточной суспензии для проточной цитофлуорометрии проводили по стандартной процедуре, включающей удаление эритроцитов и обработку буферным раствором с 0,1 % сапонина с использованием коммерческих реагентов для FACS фирмы Becton Dickinson, США. Подсчет клеток в образцах проводили с помощью электронного счетчика клеток Scepter PHCC0000 (Millipore, США) по стандартной процедуре. Подготовленную суспензию клеток с концентрацией 2×106 кл в 100 мкл вносили в пробирки объемом 5 мл по 100 мкл и добавляли по 5 мкл антител к поверхностным маркерам дифференциации CD3e (FITC, BD 553062), CD4 (APC, BD 553051), CD8а (PerCP, BD 553036), NK1.1 (CD 161b) (PE, BD 553165), CD195 (PE CCR5, BD 559923), CD45 (PerCP, BD 557235). Пробирки инкубировали 20 мин в темноте при 4 °С, после чего проводили двукратно отмывку буферным раствором CellWash (BD, 349524), центрифугировали при 220 g в течение 5 мин при температуре 4 °С. В отмытую клеточную суспензию добавляли 100 мкл буферного раствора CellWash (BD, 349524) и использовали для анализа.

Гейтирование популяции лимфоцитов осуществляли по маркеру CD45. Определение относительного количества NK-лимфоцитов выполняли по графику CD45 PerCP/SSC путем выделения лимфоцитарного гейта CD3e-NK1.1+. Определение субпопуляции Т-хелперов и цитотоксических Т-клеток – по графику FSC/SSC путем выделения лимфоцитарного гейта CD3e+CD4+ и CD3e+CD8+ соответственно, субпопуляции Т-хелперов 1 типа – по графику FSC/SSC путем выделения лимфоцитарного гейта CD3e+CD4+CD195+.

Анализ проводили на цитофлюориметре FACS Canto II в полуавтоматическом режиме с ручной подачей пробирки (BD FACS Canto II Flow Cytometer, США). Предварительно выполняли настройку дискриминатора, параметров светорассеяния, чуствительности фотоэлектронных умножителей (ФЭУ) для флюоресценции, производили введение коэффициентов компенсации. Для оценки неспецифического связывания антител клетками и настройки параметров фотоэлектронных умножителей для флюоресценции использовали изотипический (негативный) контроль по Th+ из набора (T Lymphocyte Activation Antibody Cocktail CD3e FITC/CD69PE/CD25 PE-Cy7, with Isotype Control 100 tests, 2 мл 557916), блок неспецифического связывания (BD Mouse Fc Block, 553141) и набор одноцветных контролей для настройки цветовой компенсации на основе частиц (BD CompBeads, 552844).

Калибровку прибора осуществляли по калибровочному набору Cytometry Setup & Tracking Beads (BD, 641319). Результаты обрабатывали с помощью программного обеспечения FACS Diva 6.

Данные экспериментов по фенотипированию клеток иммунной системы выражали в виде процентного содержания клеток, экспрессирующих дифференцирующие маркеры цитоксических лимфоцитов, Т-хелперов и натуральных киллеров от общего количества спленоцитов мышей в пробе.

Оценку содержания интерферона-гамма в сыворотке крови экспериментальных животных после однократного введения препарата проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) (Cusabio CSB-E04578m, Китай).

Статистическая обработка полученных данных выполнена с использованием статистического пакета Statistica 5.5. Уровень статистической значимости различий между выборками, имеющими распределение, не отличающееся от нормального, определяли с помощью t-критерия Стьюдента; между выборками, имеющими распределение, отличное от нормального, – с помощью критериев Уилкоксона и Манна-Уитни. Полученные результаты представлены в виде М ± m, где М – среднее арифметическое, m – стандартная ошибка среднего.

Таблица 1

Динамика некоторых показателей клеточного иммунитета ( %; M ± m)

Примечание. Р1 – уровень значимости различий с группой контроля, Р2 – уровень значимости различий между показателями на 7 и 14 сутки, Р3 – на 14 и 21 сутки, Р4 – на 21 и 28 сутки.

Таблица 2

Динамика содержания интерферона-гамма (пг/мл; M ± m)

Примечание. Р1 – уровень значимости различий с группой контроля, Р2 – уровень значимости различий между показателями на 14 и 21 сутки.

Результаты исследования и их обсуждение

Жизнеспособность спленоцитов в рамках лимфоцитарного гейта CD 45+ в ходе всего эксперимента колебалась от 90 до 95 %.

В ходе исследования показано, что однократное введение вакцины экспериментальным животным индуцировало статистически значимое нарастание пула NK-клеток в селезенке к 14 суткам наблюдения относительно группы контроля во всех трех сериях эксперимента (табл. 1). Затем в течение периода наблюдения (28 суток) отмечались колебания данного показателя, которые не являлись статистически значимыми.

Увеличение относительного содержания цитотоксических Т-клеток наблюдалось с 14 суток до конечной фазы исследования, достигая максимума на 28 сутки во всех сериях терапевтической вакцины, по сравнению с контрольными значениями (табл. 1).

Относительное содержание Т-хелперов в опытной группе превышало аналогичный показатель в группе контроля начиная с 14 суток, достигая максимума к 21 суткам эксперимента. На 28 сутки было отмечено незначительное снижение их процентной доли.

Субпопуляция Т-хелперов 1 типа также показала устойчивую статистически значимую динамику нарастания к 28 суткам исследований (табл. 1).

Статистически значимое увеличение уровня интерферона-гамма наблюдалось на 21 сутки, достигая максимума к 28 суткам. Таким образом, динамика содержания интерферона-гамма в сыворотке крови является однонаправленной с динамикой числа дифференцированных иммунокомпетентных цитотоксических лимфоцитов и Т-хелперов I типа, что свидетельствует о выраженности ответа клеточного звена иммунитета (табл. 2).

Выводы

Исследуемый препарат – терапевтическая вакцина против рецидивирующего респираторного папилломатоза и аногенитального кондиломатоза – после однократного внутримышечного введения мышам-самцам линии C57BL/6 в дозе 0,084 мл/кг обусловливает увеличение числа иммунокомпетентных клеток у эксперементальных животных, в том числе NK-клеток (максимально к 14 суткам наблюдения), цитотоксических Т-лимфоцитов (максимально к 28 суткам), Т-хелперов (максимально к 21 суткам), Т-хелперов 1 типа (максимально к 28 суткам), а также уровня интерферона-гамма (максимально к 28 суткам), что свидетельсвует о способности препарата стимулировать клеточное звено иммунитета.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках Государственного контракта № 16.N08.12.1024 от 14 июня 2012 г. по теме «Доклинические исследования отечественной терапевтической вакцины против рецидивирующего респираторного папилломатоза и аногенитального кондиломатоза, произведенной на основе клеток эукариот».

Рецензенты:

Ураков А.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой общей и клинической фармакологии ГБОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия» Минздрава России, научный сотрудник отдела термодеформационных процессов Института механики Уральского отделения РАН, главный внештатный специалист по фармакоэкономике Минздрава РФ, эксперт секции медико-биологических и фармацевтических наук ВАК Минобрнауки РФ, заслуженный изобретатель РФ, г. Ижевск;

Сипров А.В., д.м.н., профессор кафедры фармакологии и клинической фармакологии с курсом фармацевтической технологии ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева», г. Саранск.