Интерес к культуре так называемого «чайного гриба» возник в связи с тем, что в литературе уже давно встречаются данные о лечебных свойствах как культуральной жидкости (настоя), так и самой его биомассы [1]. Само тело «гриба» представляет собой толстую плавающую пленку, хрящевато-слизистую и расслаивающуюся, гладкую сверху и волокнисто-лохматую снизу, непривлекательного грязновато-белого цвета, которая по общему виду несколько напоминает плавающую медузу [5]. Пленка размножается очень легко, простым отделением кусочков, помещаемых в такую же среду, где она довольно быстро разрастается. Она состоит из целлюлозы, полисахаридов, жироподобные вещества (липоидную фракцию), при омылении которых обнаружен холин, и других биологически активных веществ [6, 7]. Все они являются метаболитами дрожжей и уксуснокислых бактерий и обеспечивают предположительно его лечебные свойства.
Известно, что «чайный гриб» представляет собой не отдельный самостоятельный вид гриба, а природную ассоциацию – сожительство нескольких микроорганизмов: дрожжевых грибков, сбраживающих сахара с образованием спирта и углекислого газа, и уксуснокислых бактерий, сбраживающих спирт до органических кислот, в основном уксусной. Согласно литературным данным дрожжи относятся к роду Torula, а уксуснокислые бактерии – Bactereium xylinum (по новой классификации – Acetobacterium). Причем основная масса своеобразного тела гриба – зооглея – является громадной колонией уксуснокислой бактерии Acetobacterium xylinum. Именно этой бактерии зооглея обязана своей характерной плотностью, в значительной степени обусловленной содержанием особого клетчаткоподобного вещества. По данным А.А. Бачинской [2, 3, 4, 12], эта бактерия, описанная еще в 1896 году, широко распространена в природе, встречается нередко в истечениях сока у деревьев, в культуре же давно используется с целью получения уксуса домашним способом. Б.П. Василькова отмечает наличие в этом сообществе еще других дрожжеподобных грибов, относящихся к роду Mycoderma, а также настоящих дрожжей – Saccharomyces [5]. В указанном сочетании принимает участие еще другая бактерия уксуснокислого брожения Bacterium gluconicum [11]. Линдау Г. назвал этот «гриб» – Medusomyces gisevii [13].
Таким образом, в состав ассоциации «чайного гриба» может входить разное сочетание микроорганизмов в зависимости от географических зон его происхождения. Но не вызывает сомнений тот факт, что качество конечного продукта (напитка) напрямую зависит от набора входящих в состав ассоциации культур микроорганизмов.
Целью наших исследований было проведение автоселекции природных штаммов микроорганизмов для получения ассоциации «чайного гриба», обладающей высокой биологической активностью.
Материалы и методы исследования
Для изучения видового состава популяции «чайного гриба» были взяты пробы напитка у населения г. Павлодар.
Для выделения чистых культур из найденных популяций их выращивание проводили в стационарных условиях. После 3-х суток культивирования при достижении рН культуральной жидкости значения 3,5, отобранные из ферментера пробы высевали на селективные среды: сусло-агар, мясопептонный агар, агаризованный гидролизат молока. Из выросших колоний изолировали чистые культуры. По комплексу культуральных признаков и сбраживанию углеводов культуры отнесены по определителю В.И. Кудрявцева [9] и Д. Бердже [10] к следующим видам: Acetobacterium xylinum КМП-Б1, Acetobacterium aceti КМП-Б2, Torulopsis dattilf КМП-Д1, Saccharomyces sp КМП-Д3, Hanseniaspora apiculata КМП-Д2.
Выделенные микроорганизмы присутствовали в разных образцах «чайного гриба» как в разных сочетаниях, так и в различных количествах. Это можно объяснить разными условиями выращивания его на бытовом уровне (в домашних условиях). При подборе культур для ассоциации необходимо учитывать их взаимоотношения, которые могут быть как симбиотические, так и антагонистические.
Из выделенных чистых культур микроорганизмов была составлена смешанная культура, которую в дальнейшем выращивали в полунепрерывных условиях при 28 °С, прослеживая динамику численности микроорганизмов при длительном культивировании.
Результаты исследования и их обсуждение
Полученные результаты (рисунок) наглядно демонстрируют, что при ежедневной подпитке ассоциации свежей порцией среды происходит постепенное уменьшение количества клеток Hanseniaspora apiculata. К восьмым суткам культивирования эти дрожжи полностью вымываются из ассоциации, что объясняется более низкой скоростью роста этой культуры по сравнению с таковой у других видов. Так как дрожжи Hanseniaspora apiculata характеризуются в литературе как «засорители производства», можно предположить, что отсутствие этих дрожжей в составе ассоциации не повлияет отрицательно на качественные показатели напитка.
Количество дрожжевых клеток Torulopsis dattilf и Saccharomyces sp. незначительно увеличивалось в процессе культивирования, и к моменту стационарного равновесия их соотношение равнялось 3:1.
При подсчете уксуснокислых бактерий учитывали общее количество клеток двух видов, так как по морфологическим признакам они трудноразличимы. Количество этих бактерий в популяции увеличивалось и достигало максимального количества к 6-ти суткам культивирования.
После восьми суток выращивания ассоциации «чайного гриба» наступает устойчивое равновесие в соотношении количества клеток микроорганизмов Saccharomyces sp., Torulopsis dattilf, Hanseniaspora apiculata и двух видов уксуснокислых бактерий Аcetobacterium xylinum и Acetobacterium aceti и составляет 3:1:0:6 соответственно.
Известно, что смешанные популяции существуют в равновесном состоянии благодаря положительному межвидовому взаимодействию. Чтобы определить тип взаимодействия между популяцией уксуснокислых бактерий и дрожжей, было проверено влияние одних микроорганизмов на другие через их метаболиты.
Для этого исследовалось взаимовлияние супернатантов исследуемых культур друг на друга по методу, предложенному В.П. Коровиной с соавторами [11]. В обоих случаях выявлено влияние метаболитов, которое выразилось у дрожжей в опытном варианте в более активном выделении углекислого газа при брожении, большем накоплении биомассы по сравнению с контролем. Уксуснокислые бактерии в опытном варианте накапливали большее количество органических кислот.
Первый вид – дрожжевые культуры, потребляя сахар, образуют спирт и витамины, которые стимулируют развитие уксуснокислых бактерий. Последние, в свою очередь, путем неполного окисления сахаров и спирта образуют уксусную, глюконовую, лимонную и другие органические кислоты, которые являются дополнительным источником углерода для дрожжевых клеток. Таким образом, между популяциями устанавливается равновесие через симбиотическое взаимодействие.
Динамика видового состава дрожжевых и бактериальных клеток в условиях непрерывного культивирования
Заключение
Устойчивое равновесие в соотношении количества клеток дрожжей (Saccharomyces sp., Torulopsis dattilf) и двух видов уксуснокислых бактерий (Аcetobacterium xylinum и Acetobacterium aceti) в ассоциации составляет 3:1:6, что обеспечивает ее стабильную работу за счет симбиотических взаимоотношений микроорганизмов. Оптимальные параметры культивирования, установленные опытным путем, позволяют достигнуть стабилизации новой ассоциации микроорганизмов и получить напиток стабильного качества, обеспечивающий соответствующий лечебный эффект.
Рецензенты:Мукатаева Ж.М., д.б.н., профессор, проректор по учебной работе и новым технологиям, Павлодарский государственный педагогический институт, г. Павлодар;
Жумадилов Б.З., д.б.н., заведующий кафедрой общей биологии, Павлодарский государственный педагогический институт, г. Павлодар.
Работа поступила в редакцию 01.04.2015.