Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,749

INFLUENCE OF POLYMORPHISM OF GENE TNFA-308G > A ON EXPRESSION TNF-A AT PATIENTS WITH DEVELOPMENT OF A CHRONIC TRAUMATIC OSTEOMYELITIS IN ZABAIKALIAN EDGE

Miromanov A.M. 1 Mironova O.B. 1 Miromanova N.A. 1 Trubitsyn M.V. 1
1 Chita State Medical Academy
Results of research of influence of a polymorphic marker of a gene TNFα are presented to positions –308G > A on an expression of coded proinflammatory cytokine TNFα at patients with development of a chronic traumatic osteomyelitis in Zabaikalian edge. The first group was made by 83 patients with an uncomplicated current of fractures (group of clinical comparison). The second group (n = 49) – patients with a chronic traumatic osteomyelitis (in the early postoperative period of complications it is not registered, however in the late period is fixed development of a traumatic osteomyelitis). The control group was made by practically healthy 100 donors at the age from 20 till 40 years. The generated groups were homogeneous for an age, gender, character and localisation of fractures and spent treatment. Criterion of an exception of groups was presence of acute or chronic accompanying diseases. It is established, that at patients with development of a traumatic osteomyelitis higher carriage of genotypes –308G/A, –308A/A gene TNFα is registered. Presence of a genotype –308A/A polymorphism of gene TNFα promotes higher expression of proinflammatory cytokine TNFα.
polymorphism
cytokines
fractures
chronic traumatic osteomyelitis
1. Geneticheskij polimorfizm citokinov / V.N. Cygan i dr. // vestnik Rossijskoj voenno-medicinskoj akademii. 2010. no. 2. рр. 211–219.
2. Immunologicheskie izmenenija u postradavshih s posttravmaticheskim osteomielitom dlinnyh kostej konechnostej v processe kompleksnogo lechenija / K.A. Bodachenko i dr. // Travma. 2012. T.13, no. 1. рр. 71–74.
3. Ketlinskij S.A. Citokiny / S.A. Ketlinskij, A.S. Simbircev. SPb.: Foliant, 2008. 552 р.
4. Kliniko-immunologicheskie osobennosti sepsisa i polimorfizm genov TNF-α i IL-10 u bolnyh s gnojno-hirurgicheskoj patologiej / E.V. Kurganova i dr. // Citokiny i vospalenie. 2007. no. 2. рр. 40–45.
5. Miromanov A.M. Perelomy dlinnyh kostej konechnostej: prognosticheskie kriterii razvitija oslozhnenij: dis. … d-ra med. nauk: 14.01.15, 14.03.03. Chita, 2013. 246 р.
6. Polimorfizm gena TNF-α (G-308A) u bolnyh s gnojno-vospalitelnymi oslozhnenijami pri perelomah dlinnyh kostej konechnostej v Zabajkalskom krae [Jelektronnyj resurs] / A.M. Miromanov i dr. // Zabajkalskij medicinskij vestnik. 2013. no. 1. рр. 41–45. Rezhim dostupa: http://chitgma.ru/zmv2.
7. Rydlovskaja A.V. Funkcionalnyj polimorfizm gena TNF-α i patologija / A.V. Rydlovskaja A.S. Simbircev // Citokiny i vospalenie. 2005. no. 3. рр. 4–10.
8. Sveshnikov A.A. Reshenie problemy osteomielita v osteologii // Fundamentalnye issledovanija. 2012. no. 10–1. рр. 184–193.
9. Simbircev A.S. Funkcionalnyj polimorfizm genov reguljatornyh molekul vospalenija / A.S. Simbircev, A.Ju. Gromova // Citokiny i vospalenie. 2005. T. 4, no. 1. рр. 3–10.
10. Teoreticheskie i klinicheskie aspekty bioregulirujushhej terapii v hirurgii i travmatologii / B.I. Kuznik i dr. Novosibirsk: Nauka, 2008. 311 р.
11. Cornells L. Tumor necrosis factor gene polymorphisms as severity markers in rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. 1999. Vol. 58. рр. 120–126.
12. Cvetkovic J.T. Susceptibility for and clinical manifestations of rheumatoid arthritis associated with polymorphisms of the TNF-alpha, IL-1 beta, and IL-1RA genes / J.T. Cvetkovic, S. Wallberg-Jonsson, B. Stegmayr // Reumatol. 2000. Vol. 29, no. 2. рр. 212–219.
13. Genetic polymorphisms of interleukin IL-1V, IL-1RN, IL-8, IL-10 and tumor necrosis factor {alpha} and risk of gastric cancer in a Chinese population / W. Lu [et al.] // Carcinogenesis. 2005 Vol. 26, no. 3. рр. 631–636.
14. Knight, J.C. Polymorphisms in Tumor Necrosis Factor and Other Cytokines As Risks for In fectious Diseases and the Septic Syndrome // Current Infectious Diseases Reports. 2001. Vol. 3. рр. 427–439.
15. TNF and TNFR polymorphisms in severe sepsis and septic shock: a prospective multicentre study / A.C. Gordon [et al.] // Genes Immun. 2004. Vol. 5. рр. 631–640.
16. Wilson, A.D. Genetics of tumor necrosis factor a in autoimmune, infectious and neoplastic diseas / A.D. Wilson et al. // Inflamm. 1995. Vol. 45. рр. 1–12.

Высокая частота возникновения хронического травматического остеомиелита и неудовлетворительные результаты его лечения закономерно повышают теоретический и практический интерес к изучению патогенетических механизмов развития воспалительного процесса при переломах [2, 5, 8].

Доказано, что к одним из основных факторов, определяющих особенности исхода при переломах, относится иммунная система, нарушение которой может приводить к развитию воспалительных осложнений [5, 10]. Иммунные клетки секретируют многочисленные медиаторы (цитокины), играющие ключевую роль в развитии воспалительного ответа [3].

Одним из таких медиаторов является полипептидный цитокин – TNF-α, выполняющий регуляторные и эффекторные функции в иммунном ответе и воспалении. Этот цитокин входит в группу провоспалительных цитокинов и выполняет важнейшие функции в период запуска воспаления [3]. Согласно исследованиям последних лет, важная роль в развитии осложнений отводится наследственным факторам. Генетически запрограммированный повышенный или пониженный синтез цитокинов является существенным в предрасположенности к инфицированию, развитию заболевания и длительному, осложнённому течению [1, 9].

Ген TNFα – высокополиморфный участок генома, в котором описано по меньшей мере восемь полиморфных сайтов. Некоторые из полиморфизмов оказывают влияние на уровень продукции TNF-α in vitro. Многие исследования показали ассоциацию отдельных полиморфизмов промотора гена TNFα-308G > A с различными аутоиммунными и инфекционными заболеваниями [11, 13, 14, 15].

Поскольку в нашей стране и за рубежом молекулярно-генетическим исследованиям больных травматолого-ортопедического профиля не уделено должного внимания, изучение генетического полиморфизма цитокинов, принимающих участие в механизмах регуляции межклеточных взаимодействий у больных при травме, а также поиски генетических маркеров развития осложнений представляются весьма перспективными.

Цель исследования – изучить влияние полиморфизма гена TNFα-308G > A на экспрессию TNFα у больных с развитием хронического травматического остеомиелита в Забайкальском крае.

Материалы и методы исследования

В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, 2011 – поправки) и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утверждёнными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266. Проведено обследование 132 пациентов в возрасте от 20 до 40 лет с переломами длинных костей конечностей, лечившихся в травматологических стационарах г. Читы. Первую группу составили 83 больных с неосложнённым течением переломов (группа клинического сравнения), вторую группу – 49 больных с осложнённым течением (в данной группе отмечалось заживление ран первичным натяжением, однако в позднем послеоперационном периоде зарегистрировано развитие хронического травматического остеомиелита). Контрольную группу составили 100 практически здоровых мужчин и женщин в возрасте от 20 до 40 лет.

Всем пациентам с закрытыми переломами проводилась открытая репозиция отломков с последующим металлоостеосинтезом пластинами или штифтами. Больным с открытыми переломами при поступлении выполнялась первичная хирургическая обработка и наложение аппаратов наружной фиксации. В дальнейшем применялась традиционная консервативная терапия (антибактериальные средства, дезагреганты, местное медикаментозное лечение и др.). Сформированные группы являлись относительно однородными как по возрасту, полу, характеру и локализации переломов, так и по проводимому лечению. Критерием исключения из групп являлось наличие острых или хронических сопутствующих заболеваний.

Материалом для молекулярно-генетического анализа служили образцы ДНК, выделенные из периферической венозной крови. Для исследования выбрана точковая мутация TNFα в позиции 308 (G > A). Амплификацию фрагмента исследуемого гена проводили в термоцикле (модель Ре «Бис» – М111 (ООО «Бис-Н», Новосибирск). В работе использовались стандартные наборы праймеров научно-производственной фирмы «Литех»-«SNP» (Москва). Визуализация продуктов амплификации выполнена с помощью электрофореза в 3 % агарозном геле с добавлением бромистого этидия в проходящем в ультрафиолетовом свете [6].

Определение концентрации цитокина TNF-α осуществляли с помощью набора реагентов ООО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

Сроки наблюдения за больными составили: при поступлении в стационар (1 сутки после травмы), 2, 5, 10 сутки после оперативного лечения, в дальнейшем через 3 месяца.

Полученные данные обработаны с помощью пакета программ «STATISTICA 6.1» (Stat Soft, USA), «Microsoft Office Exell 2010 for Windows 7», «БИОСТАТ». Для описания характера распределения количественных признаков определялись средние величины (М), стандартные отклонения (SD). Анализ данных между группами пациентов в разные сроки посттравматического периода проводили с помощью критерия Ньюмена – Кейлса. Для сравнения показателей пациентов с осложнённым и неосложнённым течением переломов длинных костей конечностей использовали критерий Манна – Уитни. Для анализа групп по качественному бинарному признаку применялся критерий χ2. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Первым этапом нами выявлена частота распределения аллелей и генотипов полиморфного гена TNFα-308G > A в исследуемых группах (табл. 1 и 2).

Отмечено, что в группе с хроническим травматическим остеомиелитом на долю гомозиготного генотипа –308G/G гена TNFα приходилось 12,2 %, тогда как в группе с неосложнённым течением – 73,5 %. Гетерозиготный генотип –308G/A гена TNFα встречался в 42,9 % у пациентов второй группы против 26,5 % в первой. В группе с развитием хронического травматического остеомиелита выявлено 22 (44,9 %) пациента с гомозиготной мутацией. Частота аллели –308G– гена TNFα у больных группы с неосложнённым течением переломов составила 0,87, –308А– аллели – 0,13, а в группе с хроническим травматическим остеомиелитом – 0,34 и 0,66 соответственно (р < 0,001). Таким образом, анализ полиморфизма гена TNFα-308G > A у пациентов с неосложнённым течением переломов длинных костей и развитием хронического травматического остеомиелита в позднем периоде травмы выявил достоверные различия по частотам распределения аллелей и генотипов.

Вторым этапом исследования мы определили содержание провоспалительного цитокина TNF-α в исследуемых группах (табл. 3). Установлено, что уровень TNF-α в первые сутки после травмы повышался в сравнении с контролем и оставался неизменным на 2 сутки после операции. К 5 суткам после оперативного вмешательства параметры TNF-α снижались по сопоставлению с 2 сутками после операции и на 10 сутки не отличались от контрольных значений. На 90 сутки послеоперационного периода только в группе с развитием травматического остеомиелита концентрация исследуемого показателя превышала аналогичные параметры группы контроля и клинического сравнения (табл. 3).

Таблица 1

Частота генотипов гена TNFα-308G > A и его аллельных вариантов среди здоровых резидентов и пациентов с неосложненным и осложненным (травматический остеомиелит) течением переломов длинных костей конечностей (χ2, df = 1)

 

Контроль, n = 100

Неосложненное течение, n = 83

Хронический остеомиелит, n = 49

Аллель G

OR [95 % CI]

0,825

0,867

1,39 [0,78–2,48]

0,333

0,11 [0,06–0,19]

Аллель A

OR [95 % CI]

χ2

р

0,175

0,133

0,72 [0,4–1,28]

1,24

0,26

0,663

9,29 [5,33–16,18]

70,33

0,0001

Генотип GG

OR [95 % CI]

0,71

0,735

1,13 [0,59–2,17]

0,122

0,06 [0,02–0,15]

Генотип GA

OR [95 % CI]

0,23

0,265

1,21 [0,62–2,37]

0,429

2,51 [1,21–5,23]

Генотип AA

OR [95 % CI]

χ2

р

0,06

0,00

0,09 [0,0–1,57]

5,25

0,07

0,449

12,77 [4,7–34,67]

52,84

0,0001

Примечание. р – статистическая значимость различий с контролем.

Таблица 2

Частота аллельных вариантов гена TNFα-308G > A и его генотипов среди пациентов с неосложненным течением переломов длинных костей конечностей и развитием хронического травматического остеомиелита (χ2, df = 1)

 

Неосложненное течение (n = 83)

Хронический остеомиелит (n = 49)

χ2

р

OR [95 % CI]

Аллель G

0,867

0,337

78,56

0,0001

0,08 [0,04–0,14]

Аллель A

0,133

0,663

   

12,89 [6,98–23,82]

Генотип GG

0,735

0,122

62,57

0,0001

0,05 [0,02–0,13]

Генотип GA

0,265

0,429

   

2,08 [0,99–4,39]

Генотип AA

0

0,449

   

136,6 [8,02–232,8]

Примечание. р – статистическая значимость различий между группами.

Таблица 3

Содержание TNF-α в крови больных с переломами длинных костей, пг/мл (М ± SD)

Показатель

Контроль

(n = 100)

Дни исследования

При поступлении

2 сутки после операции

5 сутки после операции

10 сутки после операции

90 сутки после операции

I группа

(n = 83)

TNF-α

р

р1

р2

р3

р4

25 ± 16,32

49,5 ± 26,6

0,0001

53,3 ± 19,9

0,0001

> 0,05

41,1 ± 21,2

0,0001

> 0,05

< 0,05

28,3 ± 20,6

0,5

< 0,05

< 0,05

< 0,05

26,2 ± 16,2

0,7

< 0,05

< 0,05

< 0,05

> 0,05

II группа

(n = 49)

TNF-α

р

р1

р2

р3

р4

 

49,3 ± 26,0

0,0001

54,6 ± 20,3

0,0001

> 0,05

42,1 ± 21,8

0,0001

> 0,05

> 0,05

29,5 ± 20,4

0,34

< 0,05

< 0,05

> 0,05

130 ± 51,5*

0,0001

< 0,05

< 0,05

< 0,05

< 0,05

Примечания: р – статистическая значимость различий с контролем; р1 – статистическая значимость различий с 1 сутками после травмы; р2 – статистическая значимость различий со 2 сутками после операции; р3 – статистическая значимость различий с 5 сутками после операции; р4 – статистическая значимость различий с 10 сутками после операции; * – статистическая значимость различий соответствующего показателя пациентов с неосложнённым течением переломов.

Таблица 4

Содержание TNFα в крови больных с неосложнённым течением переломов в зависимости от генотипа полиморфизма гена TNFα–308G > A, пг/мл (М ± SD)

Группы

Дни наблюдения

при поступлении

2 сутки

после операции

5 сутки

после операции

10 сутки

после

операции

90 сутки

после

операции

 

Генотип G/G

Контроль (n = 71)

8,34 ± 5,66

Группа с неосложнённым течением (n = 61)

19,77 ± 8,9

р = 0,0001

23,19 ± 8,36

p = 0,0001

р1 < 0,05

17,03 ± 9,14

p = 0,0001

р1 < 0,05

р2 < 0,05

10,17 ± 6,02

p = 0,074

р1 < 0,05

р2 < 0,05

р3 < 0,05

9,62 ± 5,5

p = 0,19

р1 < 0,05

р2 < 0,05

р3 < 0,05

р4 > 0,05

 

Генотип G/A

Контроль (n = 23)

27,53 ± 6,41

р5 = 0,0001

Группа с неосложнённым течением (n = 22)

44,27 ± 9,32

p = 0,0001

p5 = 0,0001

52,46 ± 9,84

p = 0,0001

p1 < 0,05

p5 = 0,0001

39,87 ± 9,92

p = 0,0001

p1 < 0,05

р2 > 0,05

p5 = 0,0001

30,05 ± 9,31

p = 0,29

p1 < 0,05

р2 < 0,05

р3 < 0,05

р5 = 0,0001

29,2 ± 7,96

p = 0,44

p1 < 0,05

р2 < 0,05

р3 < 0,05

p4 > 0,05

р5 = 0,0001

 

Генотип A/A

Контроль (n = 6)

9,15 ± 7,61

Группа с неосложнённым течением (n = 0)

Примечания: р – статистическая значимость различий с контролем; р1 – статистическая значимость различий при поступлении; р2 – статистическая значимость различий со 2 сутками после операции; р3 – статистическая значимость различий с 5 сутками после операции; р4 – статистическая значимость различий с 10 сутками после операции; р5 – статистическая значимость различий по сравнению с гомозиготами G/G.

Следующим этапом работы мы определили влияние генотипов полиморфизма гена TNFα-308G > A на уровень продукции кодируемого цитокина (табл. 4, 5).

Уровень провоспалительного цитокина TNF-α как у травмированных, так и здоровых лиц значимо различается в зависимости от носительства генотипов гена TNFα. Так, при носительстве генотипа –308G/G у пациентов I и II групп при поступлении, а также в группе контроля, концентрация цитокина TNF-α регистрировалась соответственно в 2,2, 2,2 и 3,3 раза ниже по сравнению с носителями генотипа –308G/A (р < 0,0001). В контрольной группе и у пациентов с осложненным течением травматической болезни при носительстве генотипа –308GА/A зафиксировано увеличение уровня TNF-α соответственно в 1,4 и 1,9 раза по сопоставлению с генотипом –308G/A (р < 0,0001). Аналогичная картина экспрессии TNFα в зависимости от выявляемого генотипа зарегистрирована во все последующие дни исследования (табл. 5).

Таким образом, полученные результаты показывают, что наличие генотипа –308А/А полиморфизма гена TNFα способствует более высокой экспрессии цитокина TNF-α, что согласуется с данными литературы [4, 7]. Однако, функциональная значимость полиморфизма гена TNFA-308G > A в работах разных исследователей неоднозначна, что, по-видимому, обусловлено природой патогенеза заболевания, особенностями клеточных линий, стимуляторов и другими условиями эксперимента [12, 14, 16].

Таблица 5

Содержание TNFα в крови больных с развившимся травматическим остеомиелитом в зависимости от генотипа полиморфизма гена TNFα-308G > A, пг/мл (М ± SD)

Группы

Дни наблюдения

при поступлении

2 сутки

после операции

5 сутки

после операции

10 сутки

после

операции

90 сутки

после

операции

 

Генотип G/G

Контроль (n = 71)

8,34 ± 5,66

Группа с развившимся остеомиелитом (n = 6)

20,58 ± 5,84

p = 0,0001

24,69 ± 6,17

p = 0,0001

р1 > 0,05

18,15 ± 9,45

p = 0,0001

р1 > 0,05

p2 > 0,05

14,6 ± 7,34

p = 0,0001

р1 > 0,05

р2 > 0,05

р3 > 0,05

51,67 ± 16,1

p = 0,0001

р1 < 0,05

р2 < 0,05

р3 < 0,05

р4 < 0,05

 

Генотип G/A

Контроль (n = 23)

27,53 ± 6,41

р5 = 0,0001

Группа с развившимся остеомиелитом (n = 21)

45,03 ± 8,73

p = 0,0001

p5 = 0,0001

54,78 ± 10,91

p = 0,0001

p1 < 0,05

p5 = 0,0001

41,42 ± 12,0

p = 0,0001

p1 > 0,05

р2 < 0,05

p5 = 0,0001

39,5 ± 9,06*

p = 0,0001

p1 > 0,05

р2 < 0,05

р3 > 0,05

p5 = 0,0001

131,7 ± 23,2*

p = 0,0001

p1 < 0,05

р2 < 0,05

р3 < 0,05

p4 < 0,05

р5 = 0,0001

 

Генотип A/A

Контроль (n = 6)

39,15 ± 7,61

р5 = 0,0001

р6 = 0,0001

Группа с развившимся остеомиелитом (n = 22)

84,44 ± 13,84

p = 0,0001

p5 = 0,0001

p6 = 0,0001

76,82 ± 9,84

p = 0,0001

p1 > 0,05

p5 = 0,0001

p6 = 0,0001

66,84 ± 11,38

p = 0,0001

p1 < 0,05

р2 > 0,05

p5 = 0,0001

p6 = 0,0001

59,07 ± 11,09

p = 0,0001

p1 < 0,05

р2 < 0,05

р3 > 0,05

p5 = 0,0001

p6 = 0,0001

184,1 ± 37,2

p = 0,0001

p1 < 0,05

р2 < 0,05

р3 < 0,05

p4 < 0,05

р5 = 0,0001

p6 = 0,0001

Примечания: р – статистическая значимость различий с контролем; р1 – статистическая значимость различий при поступлении; р2 – статистическая значимость различий со 2 сутками после операции; р3 – статистическая значимость различий с 5 сутками после операции; р4 – статистическая значимость различий с 10 сутками после операции; р5 – статистическая значимость различий по сравнению с гомозиготами G/G; р6 – статистическая значимость различий по сравнению с гетерозиготами G/А; * – статистическая значимость различий с неосложнённым течением переломов.

У пациентов с хроническим травматическим остеомиелитом наиболее часто встречается гетерозиготный генотип мутаций, что повышает вероятность развития воспалительных осложнений при переломах длинных костей конечностей, а при выявлении гомозиготной мутации гена TNFα-308G > А отмечено более тяжелое и длительное течение раневой инфекции, что согласуется с данными литературы и подтверждает возможную ассоциативную связь между повышенной частотой аллеля TNFα-308А и тяжелым течением гнойно-воспалительных заболеваний. Данный факт указывает на важный вклад аллельного полиморфизма генов цитокинов в индивидуальные различия больных по характеру течения инфекционного процесса и эффективности механизмов протективного иммунитета вследствие разной экспрессии кодируемого цитокина [3, 4, 6].

Выводы

1. У больных с развитием травматического остеомиелита регистрируется более высокое носительство генотипов –308G/A, –308A/A гена TNFα.

2. Наличие генотипа –308А/А полиморфизма гена TNFα у больных с переломами длинных костей конечностей способствует более высокой экспрессии провоспалительного цитокина TNF-α.

Рецензенты:

Цыбиков Н.Н., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой патологической физиологии, ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Чита;

Намоконов Е.В., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой общей и специализированной хирургии с курсом топографической анатомии и оперативной хирургии, ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Чита.