Одним из актуальных направлений в фармацевтической технологии является разработка липосомальных лекарственных форм, обладающих рядом преимуществ. Введенные в организм липосомы с лекарственным веществом взаимодействуют с мембранами клеток, связываются с ними и передают клетке лекарственный препарат. Включение лекарственных средств в липосомы может изменить фармакинетику и биораспределение препарата, приводящее к повышению эффективности.
При этом важно проводить исследование в отношении лекарственных средств, отличающихся нестабильностью и высокой скоростью метаболизма. К числу таких препаратов относится кислота янтарная [2, 3]. Известно, что при инъекционном введении пик концентрации определяется в течение первой минуты, с дальнейшим быстрым снижением без кумуляции и возвращением её уровня к фоновым значениям вследствие метаболизма до воды и углекислого газа. При этом для развития механизма антиоксидантной защиты в некоторых случаях рекомендуется увеличивать концентрацию потребляемого лекарственного средства, что может вызвать некоторые осложнения со стороны желудочно-кишечного тракта. Поэтому создание новой лекарственной формы кислоты янтарной с улучшенными биофармацевтическими свойствами является актуальной задачей.
Целью настоящего исследования является разработка липосомальной лекарственной формы кислоты янтарной с экстрактом прополиса.
Материалы и методы исследования
Кислота янтарная (ФСП 42-009–00), лецитин яичный (ТУ-6-09-001–870); Экстракт прополиса 10 %, полученный методом перколяции с использованием спирта этилового 70 %.
Для получения липосомальной суспензии (из расчета на 10 лекарственных форм) 5 г яичного лецитина растворяли в диэтиловом эфире при постоянном перемешивании на шейкере в течение 10 минут, эфир выпаривали на роторном испарителе под вакуумом на водяной бане при 37 °С до образования липидной пленки, которую затем сушили в течение 2 ч при комнатной температуре. Полученную фосфолипидную пленку гидратировали 10 мл раствора, содержащего 1 г кислоты янтарной. Раствор взбалтывали в течение 1 часа на шейкере, затем добавляли 2 мл экстракта прополиса и продолжали перемешивание в течение 2 часов. Для получения малых однослойных липосом использовали экструзионный метод, продавливая дисперсии липосом через мембранные фильтры «Nuclepore» (Whatman, Великобритания) с диаметром пор 400 нм по 20 раз с применением ручного мини-экструдера (Avanti Mini-Extruder, США). Полученный продукт представлял собой дисперсию липосом в воде.
Для определения степени включения кислоты янтарной к 10 мл липосомальной формы (точная навеска) прибавляли 10 мл раствора натрия хлорида 2 М, нагревали на водяной бане в течение 10 минут для получения гомогенного раствора, а затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут до полного осаждения липосом. Надосадочную жидкость помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 10 мл 0,1 моль/л раствора натрия гидроксида, растворяли невключившуюся кислоту янтарную Объем раствора доводили до метки 0,1 моль/л раствором натрия гидроксида, хорошо перемешивали. Измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре СФ-56 в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. Параллельно проводили такое же определение с раствором РСО кислоты янтарной.
Определение антиоксидантной активности проводили в опытах in vitro. В качестве объекта исследования использовали кровь доноров мужского пола в возрасте 20–25 лет. Для предотвращения активации нейтрофилов во время выделения проводили все манипуляции при 4 °C. Использовали фиколл-урографин ρ = 1,077 и ρ = 1,119 г/см3. Вначале создавали двойной градиент фиколл-урографина: первым в пробирку вносили раствор фиколл-урографина, имеющий плотность ρ = 1,119 г/см3, затем на него аккуратно наслаивали раствор фиколла с плотностью ρ = 1,077 г/см3. Гепаринизированную кровь наслаивали на двойной градиент фиколл-урографина, центрифугировали 45 мин при 3000 об/мин. После центрифугирования получали кольца мононуклеарных клеток (верхнее) и нейтрофилов (НФ) (нижнее). Полученное кольцо мононуклеарных клеток удаляли, нейтрофильное кольцо отбирали и переносили в чистую пробирку, содержащую среду, свободную от ионов Ca2+ и Mg2+. Клетки дважды отмывали, центрифугируя 10 мин при 1500 об/мин. Количество НФ в клеточной суспензии подсчитывали в камере Горяева с использованием прижизненной окраски раствором метиленового синего в кислоте уксусной 3 %. Для достижения концентрации 5∙106 НФ/мл клеточную суспензию разводили раствором Хенкса [1].
Определение пероксида водорода в НФ проводили спектрофотометрически по методу A. Pick и Y. Keisari с использованием раствора фенолового красного 0,2 % [5]. Метод основан на способности пероксида водорода образовывать неидентифицированный продукт. Для этого к 1,64 мл фосфатного буферного прибавляли 30 мкл раствора фенолового красного и 600 мкл суспензии нейтрофилов. В опытный образец вносили липосомальную лекарственную форму. В раствор сравнения вместо испытуемого лекарственного средства добавляли воду очищенную. Пробирки инкубировали при 37 °С в течение 60 минут, а затем реакцию останавливали введением в реакционную смесь 20 мкл 1 М раствора натрия гидроксида. Интенсивность светопоглощения определяли на спектрофотометре СФ-56 в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. Измерение проводили против контрольной пробы, в которой реакция была остановлена сразу после добавления красителя.
Определение активности каталазы в НФ проводили по реакции с аммония молибдатом. Для этого в опытную пробирку отмеряли 2 мл свежеприготовленного 0,03 % раствора перекиси водорода, 100 мкл выделенной суспензии нейтрофилов и раствор липосом. В пробирку сравнения вместо раствора лекарственного средства прибавляли в том же объеме воду очищенную. В контрольный раствор отмеряли 2,1 мл воды очищенной и 100 мкл суспензии нейтрофилов. В качестве холостой пробы использовали раствор, состоящий из 2 мл 0,03 % раствора пероксида водорода и 0,2 мл воды очищенной. Подготовленные таким образом растворы инкубировали при 37 °С в течение 10 минут, а затем в каждую пробирку добавляли по 1 мл 4 % раствора аммония молибдата. Интенсивность окраски измеряли при 410 нм против контрольной пробы [4].
Определение малонового диальдегида, реагирующего с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активных продуктов) проводили в фосфолипиде, в липосомах с кислотой янтарной и липосомах с кислотой янтарной и экстрактом прополиса по методике. К 50 мкл суспензии липосом добавляли 450 мкл раствора тиобарбитуровой кислоты (2,5 мг/мл) в 2 % ортофосфорной кислоте. Полученный раствор инкубировали при 100 °С в течение 1 часа и затем после добавления 500 мкл спирта этилового 96 % регистрировали спектр в диапазоне 450–650 нм.
Содержание ТБК рассчитывали по формуле
С = 0,81 + 106 (А535 – А580).
Результаты исследования и их обсуждение
Было установлено, что полученные липосомы характеризуются степенью включения кислоты янтарной 58,5 %. Для увеличения этого показателя нами была предпринята попытка введения криопротектора совместно с введением кислоты янтарной. Установлено, что максимальное включение (69,7 %) наблюдается при использовании 0,2 % раствора сахарозы. Для повышения стабильности и достижения максимального включения кислоты янтарной нами предложено использовать сочетание фосфолипида с холестерином. Введение холестерина совместно с лецитином повышает прочность липосомальной мембраны за счет ограничения подвижности жирнокислотных цепей фосфолипида. Установлено, что при соотношении 1:0,2 наблюдается максимальный эффект включения кислоты янтарной (около 80 %).
В процессе хранения липосом и препаратов, полученных на их основе, наблюдается окисление липидов с образованием малонового диальдегида и гидроперекисей липидов, а также увеличивается содержание непредельных группировок в липидах. Подобные изменения напрямую отражаются на стабильности липосомальной мембраны и могут приводить к снижению времени сохранения целостности мембраны и разрушению липосомального препарата. Введение в препарат стабилизирующих добавок может как ингибировать процесс окисления, так и ускорять его.
Полученные образцы инкубировались при температуре 37 °С. На 1, 2, 6, 10 сутки производился забор образцов в объеме 1 мл, хранившихся до экспериментов в морозильной камере при –20 °С, в которых определяли ТБК-продукты. Результаты представлены в табл. 1.
Было установлено, что присутствие в качестве антиоксиданта кислоты янтарной препятствует образованию продуктов окисления липидов, а введение в качестве действующего вещества экстракта прополиса способствует потенцированию антиоксидантного эффекта.
Для подтверждения этой гипотезы в опытах in vitro определили содержание перекиси водорода в нейтрофилах и активность каталазы в условиях применения липосомальной лекарственной формы.
Определение активности каталазы проводили при введении водного раствора кислоты янтарной в форме субстанции, раствора, полученного при растворении капсулы с кислотой янтарной и липосомальной лекарственной формы с кислотой янтарной. Для этого мы проводили эксперимент в фосфатном буфере сразу, через 1, 2, 6 часов после приготовления.
Установлено, что растворы субстанции кислоты янтарной в течение времени разлагаются и активность каталазы уменьшается. Более стабильными являются капсулированные формы кислоты янтарной, а также липосомальная лекарственная форма.
Таблица 1
Результаты определения ТБК-продуктов
|
Образец |
Концентрация малонового альдегида, нмоль/л |
|||
|
1 сутки |
2 сутки |
6 сутки |
10 сутки |
|
|
Смесь лецитина с холестерином |
6,8 |
6,83 |
7,14 |
8,16 |
|
Липосомы с кислотой янтарной |
5,86 |
5,88 |
5,94 |
6,03 |
|
Липосомы с кислотой янтарной и экстрактом прополиса |
5,7 |
5,73 |
5,81 |
5,83 |
Таблица 2
Влияние кислоты янтарной на активность каталазы в опытах in vitro
|
Время |
Активность каталазы в интактных нейтрофилах, мкат/л |
Активность каталазы в нейтрофилах в присутствии водного раствора кислоты янтарной, мкат/л |
Активность каталазы в нейтрофилах в присутствии раствора кислоты янтарной (субстанция в капсуле), мкат/л |
Активность каталазы в нейтрофилах в присутствии липосомальной формы кислоты янтарной, мкат/л |
|
Сразу |
0,7753 ± 0,027 |
0,8052 ± 0,049 |
0,8227 ± 0,035 |
0,8335 ± 0,017 |
|
Через 1 час после приготовления |
0,7991 ± 0,037 |
0,8114 ± 0,044 |
0,8314 ± 0,031 |
|
|
Через 2 часа после приготовления |
0,7968 ± 0,031 |
0,7993 ± 0,041 |
0,8214 ± 0,026 |
|
|
Через 6 часов после приготовления |
0,7686 ± 0,015 |
0,7887 ± 0,036 |
0,8176 ± 0,027 |
Аналогичные результаты были получены при исследовании концентрации пероксида водорода. Показатель оптической плотности в интактных нейтрофилах был выше данного показателя в образцах, содержащих кислоту янтарную. Было установлено, что при 600 нм величина оптической плотности раствора сравнения составила около 1,2 единиц оптической плотности (е.о.п.), в то время как введение кислоты янтарной значительно понижает данный показатель. Так, спектр поглощения испытуемых образцов, содержащих кислоту янтарную (субстанция и лекарственные формы), характеризовался величиной оптической плотности 0,93–0,98, что свидетельствовало о снижении концентрации пероксида водорода в нейтрофилах.
Выводы
1. Разработана технология получения липосомальной лекарственной формы с кислотой янтарной и экстрактом прополиса.
2. Установлено, что введение раствора сахарозы, а также холестерина способствует увеличению степени включения кислоты янтарной до 80 %.
3. Установлено ингибирование малонового альдегида в присутствии кислоты янтарной и экстракта прополиса.
4. В опытах in vitro показан антиоксидантный эффект кислоты янтарной и ее лекарственных форм.
Рецензенты:Лиходед В.А., д.фарм.н., профессор, заведующий кафедрой фармации, ГБОУ ВПО ЮУГМУ, г. Челябинск;
Синицкий А.И., д.м.н., доцент кафедры химии фармацевтического факультета, ГБОУ ВПО ЮУГМУ, г. Челябинск.
Работа поступила в редакцию 06.03.2015.