В различных исследованиях показана все возрастающая во многих странах заболеваемость населения сахарным диабетом (СД), приводящая к увеличению распространенности хронических осложнений, что обусловливает высокую социальную значимость изучаемой патологии. Совершенствование диагностических и лечебных мероприятий при СД позволило более эффективно предупреждать развитие сосудистых осложнений [8, 11], в том числе с помощью средств, имеющих антиоксидантные свойства [4, 5, 14], однако до сих пор не существует единого мнения о терапевтической тактике ведения больных СД с применением препаратов с антиоксидантной направленностью, остаются не до конца разработанными принципы дифференцированного антиоксидантного лечения в зависимости от выраженности осложнений, а также не учтено влияние антиоксидантной терапии на отдельные звенья эндогенной антиоксидантной системы. Поэтому продолжается поиск и разработка новых способов коррекции дисбаланса в работе прооксидантно-антиоксидантной системы, в том числе рассматривается возможность повышения потенциала антирадикальной защиты в организме путем усиления реакций изотопного обмена, например дейтерий-протий (D/H), например при введении в пищевой рацион воды с модифицированным изотопным составом с пониженным (по отношению к природному соотношению этих изотопов) содержанием дейтерия [2, 13, 15].
В связи с вышеизложенным целью настоящей работы была оценка влияния воды с пониженным содержанием дейтерия на состояние прооксидантно-антиоксидантной системы в крови и тканях внутренних органов у крыс при моделировании аллоксанового диабета и его коррекции путем снижения концентрации дейтерия.
Материалы и методы исследования
При выполнении исследования было изучено состояние прооксидантно-антиоксидантной системы у 42 крыс. Эксперимент проводили на самцах беспородных крыс, из которых по принципам парных аналогов было сформировано 3 группы животных, средней массой 220 ± 20 г: группа 1 – крысы, потребляющие дистиллированную минерализованную воду (150 ppm) и обычный (виварный) рацион (n = 14, интактные животные); группа 2 – крысы (n = 14), потребляющие дистиллированную минерализованную воду (150 ppm), у которых путем введения аллоксана (в дозе 17 мг/100 г внутрибрюшинно однократно) была создана модель экспериментального сахарного диабета (группа сравнения); 3 группа – крысы (n = 14), потребляющие дистиллированную минерализованную воду с пониженным содержанием дейтерия (40 ppm), у которых путем введения аллоксана (в дозе 17 мг/100 г внутрибрюшинно однократно) была создана модель экспериментального сахарного диабета. Эксперимент был разделен на 2 этапа: 1 этап – моделирование сахарного диабета у животных в группах 2 и 3; 2 этап – когда на протяжении 30-ти суток крысы потребляли виварный рацион и питьевую воду с различной концентрацией дейтерия по выше представленной схеме. Забор крови и органов у животных в группах 2 и 3 производили на 30-й день после моделирования аллоксанового диабета.
Определение концентрации дейтерия в полученной воде и плазме крови было проведено на импульсном ЯМР спектрометре JEOL JNM-ECA 400MHz. по методике [1]. Для определения изотопного состава лиофилизированных органов лабораторных животных использовался масс-спектрометр DELTAplus, (Finnigan, Германия) по методике [1].
При оценке интенсивности свободнорадикального окисления в плазме крови использовали метод люминол-зависимой H2O2-индуцированной хемилюминесценции, максимум вспышки хемилюминесценции (МВХЛ) и площадь хемилюминесценции (ПХЛ) измеряли на хемилюминотестере ЛТ-01 по методике [3] и выражали в условных единицах (усл. ед.) и единицах площади (ед. пл.) соответственно. Хемилюминесценцию (ХЛ) в гомогенатах тканей внутренних органов изучали на хемилюминометре «Lum-5773» (Россия), с использованием лицензионного программного обеспечения PowerGraph 3.3. Определение количества продуктов окислительной модификации проводили с помощью реакции с тиобарбитуровой кислотой по методике [7] и выражали в виде тиобарбитурового числа (ТБЧ). Исследование суммарной антиокислительной активности (САОА) проводили амперометрическим методом на анализаторе антиоксидантной активности «Яуза-01-ААА» по способу [12] и выражали в мг/л аскорбиновой кислоты. Определение SH-групп проводили на основании взаимодействия с 5,5’-дитио-бис-(2-нитробензойной) кислотой [7]. Интегральную оценку функционирования низкомолекулярного звена прооксидантно-антиоксидантной системы осуществляли по способу [9]. Биохимические исследования проводили на автоматическом биохимическом анализаторе Chem Well 2900 T (USA), используя наборы реактивов Spinreact (Spain). В качестве лабораторно-биохимических показателей эндотоксикоза в плазме крови крыс определяли: альбумин, аспартатаминотрансфераза (АСТ), аланинаминотрансфераза (АЛТ), креатинин, мочевина, глюкоза, билирубин. Изучение молекул средней и низкой массы (МСиНМ) в эритроцитах и плазме проводили по методике [6] и выражали в единицах оптической плотности (е.о.п.). Интегральную оценку состояния функциональной системы детоксикации проводили по способу [10] с помощью индекса эндогенной интоксикации.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили в соответствии с методами, принятыми в вариационной статистике, с использованием свободного программного обеспечения – системы статистического анализа R (R Development Core Team, 2008, достоверным считали различие при р < 0,05).
Результаты исследования и их обсуждение
В результате проведенных исследований было установлено, что в тканях органов функциональной системы детоксикации крыс наблюдалось уменьшение дейтерия при использовании в их питьевом рационе воды с модифицированным изотопным составом. У крыс, потребляющих воду с остаточным содержанием дейтерия 40 ppm, уровень дейтерия в лиофилизированной ткани сердца снизился на 12,3 %, в лиофилизированной ткани печени на 6,1 %, в лиофилизированной ткани почек уровень дейтерия снизился на 13,6 %. Данные изменения свидетельствуют об интенсивных реакциях изотопного обмена между жидкими средами организма и биологическими молекулами в тканях. При этом в тканях наблюдается более высокий уровень дейтерия (в среднем на 33–43 %), чем в плазме, что связано с небольшой скоростью реакций обмена изотопов водорода. Кроме того, на изотопный обмен в тканях, помимо воды, также существенное влияние оказывает потребляемая пища, обеспечивающая поступление питательных веществ с естественным (природным) изотопным D/H составом.
В ходе реакций изотопного обмена (D/H) в тканях может наблюдаться неравномерное распределение изотопов водорода, а также преимущественное накопление одной из его форм. Это происходит в результате термодинамической неравноценности изотопных соединений. Несомненно, замещение дейтерия протием в высокомолекулярных соединениях не окажет существенного влияния на их термодинамическое состояние. Тем не менее за счет обмена изотопов водорода в легко диссоциирующих группах (гидроксильных (–ОН), тиоловых (–SH), первичных и вторичных аминогрупп (–NH2, = NH)) активных и аллостерических центров ферментов в ходе осуществления реакций биокатализа может изменяться скорость каталитических процессов в результате снижения энергии активации переходных состояний молекулы. Все это может приводить к повышению интенсивности биохимических процессов.
При моделировании аллоксанового диабета у крыс наблюдали повышение уровня глюкозы в 2,2 раза, сопровождающееся возрастанием активности ферментов, характеризующих цитолитические процессы (АСТ, АЛТ), увеличением концентраций креатинина, билирубина и мочевины (таблица). При этом по данным хемилюминесценции было выявлено достоверное усиление интенсивности процессов свободнорадикального окисления в крови (на 73,2 %, р < 0,05) и внутренних органах: сердце (на 58,4 %), печени (на 32,9 %), почке (на 9,3 %). На фоне столь выраженных метаболических нарушений выявлен значительный дисбаланс функционирования прооксидантно-антиоксидантной системы у крыс в группе 2, который характеризовался повышением: количества продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в плазме крови на 81,2 %; базального количества продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, в эритроцитах на 35,7 %; количества продуктов окислительной модификации (Fe2+-индуцированных) в эритроцитах на 64,0 %, что превышало аналогичные показатели в группе 3 (таблица), получающей воду с пониженным содержанием дейтерия. В группе 3 аналогичные показатели, отражающие выраженность процессов пероксидации, были меньше, чем в группе 2 на 11,3 % (количество продуктов окислительной модификации в плазме), 7,0 и 7,2 % (базальное и Fe2+-индуцированное количество продуктов окислительной модификации соответственно в эритроцитах).
Показатели прооксидантно-антиоксидантной системы и функциональной системы детоксикации при экспериментальном сахарном диабете
|
Показатель |
Группа 1 |
Группа 2 |
Группа 3 |
|
АСТ, ед. акт. |
163,20 ± 11,65 |
192,49 ± 8,67* |
182,71 ± 9,60* |
|
АЛТ, ед. акт. |
45,03 ± 2,89 |
106,92 ± 4,73* |
97,64 ± 3,28* |
|
Альбумин, г/л |
32,51 ± 1,79 |
32,38 ± 1,62 |
33,59 ± 2,12 |
|
Билирубин, мкмоль/л |
5,78 ± 0,27 |
8,34 ± 0,30* |
8,29 ± 0,17* |
|
Креатинин, мкмоль/л |
44,81 ± 1,43 |
64,21 ± 2,27* |
62,81 ± 0,93* |
|
Мочевина, ммоль/л |
6,89 ± 0,34 |
9,08 ± 0,41* |
8,73 ± 0,45* |
|
Глюкоза, ммоль/л |
5,84 ± 0,25 |
12,91 ± 0,63* |
10,42 ± 0,38* |
|
ТБЧ плазмы, е.о.п. |
0,260 ± 0,012 |
0,471 ± 0,023* |
0,418 ± 0,019* |
|
ТБЧ эритроцитов, е.о.п. |
0,501 ± 0,027 |
0,680 ± 0,037* |
0,632 ± 0,034* |
|
ТБЧ (Fe2+) эр., е.о.п. |
0,608 ± 0,033 |
0,997 ± 0,053* |
0,925 ± 0,051* |
|
ХЛ, печень, ед. |
0,283 ± 0,004 |
0,376 ± 0,010* |
0,379 ± 0,013* |
|
ХЛ, почка, ед. |
0,419 ± 0,005 |
0,458 ± 0,009* |
0,422 ± 0,005 |
|
ХЛ, сердце, ед. |
0,221 ± 0,003 |
0,350 ± 0,007* |
0,297 ± 0,004* |
|
ВХЛмакс, усл. ед. |
1,993 ± 0,065 |
3,452 ± 0,113* |
3,041 ± 0,106* |
|
ХЛпл, усл. ед. |
2,597 ± 0,086 |
5,176 ± 0,171* |
4,584 ± 0,150* |
|
САОА, мг/л |
1,030 ± 0,034 |
0,685 ± 0,022* |
0,765 ± 0,024* |
|
SH-гр., е.о.п. |
0,287 ± 0,006 |
0,195 ± 0,008* |
0,203 ± 0,004* |
|
МСиНМэр., е.о.п. |
4,035 ± 0,215 |
5,792 ± 0,382* |
5,286 ± 0,349* |
|
МСиНМпл., е.о.п. |
2,917 ± 0,076 |
4,843 ± 0,126* |
4,614 ± 0,120* |
Примечание. * – p < 0,05 по сравнению с показателями группы 1 (контрольная).
При этом было выявлено повышение интенсивности хемилюминесценции плазмы крови: максимума вспышки на 73,2 и 52,6 % в группах 2 и 3 соответственно в сравнении с контрольной группой, тогда как суммарный показатель низкомолекулярного звена антиоксидантной системы плазмы, измеренный с помощью амперометрического метода, был снижен на 33,5 и 25,7 % в группах 2 и 3 соответственно, что указывает на более существенный дисбаланс соотношения прооксидантных и антиоксидантных факторов у животных с аллоксановым диабетом, получавших воду 150 ppm (по дейтерию), в сравнении с крысами, потребляющими воду 40 ppm. Количество тиоловых групп у крыс с моделью аллоксанового диабета также было снижено на 32,1 и 29,3 % в группах 2 и 3 соответственно, что подтверждает нарушение регенерации низкомолекулярных антиоксидантных факторов у крыс в этих группах в условиях окислительного стресса, обусловленного развитием аллоксанового диабета.
Интегральный показатель функционирования низкомолекулярного звена прооксидантно-антиоксидантной системы (коэффициент окислительной модификации биомолекул эритроцитов) в группе 2 был на 17,9 % выше, чем у крыс в группе 3, что подтверждает перспективность использования воды с пониженным содержанием дейтерия при комплексной коррекции нарушений в работе антиоксидантной системы, наблюдающихся при развитии диабета. При этом наблюдалось уменьшение индекса эндогенной интоксикации в группе 3 на 27,1 % в сравнении с показателями группы 2, что указывает на повышение функциональной активности органов детоксицирующей системы у крыс, потреблявших воду с пониженным содержанием дейтерия.
Выводы
Таким образом, полученные данные, характеризующие состояние прооксидантно-антиоксидантной системы, свидетельствуют о значимой роли дисбаланса в ее работе при развитии метаболических нарушений у крыс с аллоксановым диабетом, в том числе и при формировании патологических изменений в органах детоксикации. При этом отмечено корригирующее влияния воды с пониженным содержанием дейтерия (40 ppm) на состояние как прооксидантно-антиоксидантной, так и детоксицирующей систем у крыс с аллоксановым диабетом, что позволяет рекомендовать применение реакций изотопного обмена при комплексной коррекции нарушений метаболизма, связанных с недостаточностью инсулина. В целом применение в комплексном лечении воды с пониженным содержанием дейтерия позволило уменьшить выраженность нарушений в работе антиоксидантной системы и снизить интенсивность процессов свободнорадикального окисления в крови и тканях внутренних органов, что сопровождалось менее значимым накоплением эндотоксических субстанций в плазме крови.
Рецензенты:Гайворонская Т.В., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Краснодар;
Быков И.М., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой фундаментальной и клинической биохимии, ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Краснодар.
Работа поступила в редакцию 10.03.2015.