Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

В последние годы появились работы, указывающие не только на высокую биосовместимость наноалмазов (НА), не имеющих токсических примесей, но и на их способность влиять на биологические свойства и функциональную активность клеток, взаимодействующих с ними [2, 5, 7, 8]. Например, in vitro на поверхностях пластиковых чашек Петри, покрытых НА, отмечена стимуляция процессов пролиферации и дифференцирования остеобластов, нейрональных стволовых клеток человека по сравнению с обычным полистиролом. Было отмечено, что такая стимуляция может осуществляться посредством запуска механизма клеточной сигнальной трансдукции через фибронектин-интегрин-FAK-ERK путь активации клеток [6, 10]. Однако, как отметили исследователи, использование НА в качестве возможного сорбента и даже лечебного средства в профилактике и лечении ряда заболеваний является, вероятно, перспективным только при условии исключения рисков вероятных осложнений.

В настоящее время в медицине рассматривается несколько направлений применения НА: в качестве покрытия на трущихся поверхностях протезов в восстановительной хирургии, в качестве носителей лекарственных средств в фармакологии и в качестве сорбентов в средствах наружного применения, когда при их использовании возможен «захват» НА фагоцитирующими клетками, например макрофагами (МФ) [8, 9]. В связи с этим полезно располагать сведениями о влиянии НА на функциональный статус МФ их фагоцитирующих, например, на их прорегенераторный потенциал, который определяется их способностью синтезировать и секретировать, кроме гидролаз, различные факторы роста, регулирующие процессы воспаления и репарации в поврежденных тканях.

В этой связи целью настоящего исследования было изучение влияния частиц наноразмерных алмазов марки «УДА-В-ГО» на экспрессию и секрецию макрофагами мышей факторов роста: трансформирующего фактора роста (TGFB1/TGF-бета), эпидермального фактора роста (EGF), фактора роста кератиноцитов (KGF/FGF7) и основного фактора роста фибробластов (bFGF/FGF2).

Материалы и методы исследования

Исследование было выполнено in vitro на МФ, выделенных из перитонеального транссудата мышей-самцов линии BALB c 2-месячного возраста, с массой тела 21–22 г., полученных из питомника Института клинической иммунологии СО РАМН (г. Новосибирск, Россия). Перитонеальные клетки получали после выведения животных из эксперимента путем дислокации позвонков в шейном отделе под легким эфирным наркозом. Клетки из перитонеального транссудата эксплантировали в культуру и культивировали при 37 °С, инкубировали в пластиковых чашках Петри (диаметром 40 мм) в течение 3-х часов на покровных стеклах для прикрепления МФ (106 клеток в 1,5 мл среды 199, содержащей 10 % сыворотки эмбрионов коров). Через 3 часа неадгезированные клетки смывали средой для культивирования. Полученные первичные культуры МФ культивировали в течение 24 часов с целью их адаптации. В экспериментах использовали искусственно полученные НА «УДА-В-ГО» в диапазоне размеров 4–6 нм. Наноалмазы (НА) марки «УДА-В-ГО» были предоставлены НПО «Алтай» (Россия, г. Бийск), физико-химические характеристики которых достаточно хорошо исследованы [2, 3].

Исследование влияния НА частиц на экспрессию трансформирующего фактора роста (TGFB1/TGF-бета), эпидермального фактора роста (EGF), фактора роста кератиноцитов (KGF/FGF7) и основного фактора роста фибробластов (bFGF/FGF2) в МФ проводили через 1, 3, 24 и 48 часов после внесения НА в первичные 24-часовые культуры МФ. В среду для культивирования вносили 1,6 % стерильную суспензию НА в бидистиллированной воде до конечной концентрации в культуральной среде в 20 мкг в 1 мл. После этого суспензию тщательно перемешивали и обрабатывали ультразвуком при помощи ультразвукового дезинтегратора МУЗА-0,1/22-М в течение 10 с при мощности 75 Вт для разрушения вероятных агрегатов из НА. Внесение НА в культуры МФ осуществляли путем замены изначальной среды культивирования средой, содержащей НА в соответствующей концентрации. Эти группы рассматривали как экспериментальные. Согласно нашим предварительным данным, выбранная концентрация НА не вызывает цитотоксических эффектов в отношении МФ [5]. Контролем служили МФ, которым в среду для культивирования через 24 часа культивирования вносили свежую среду взамен предыдущей, в которую предварительно вносили бидистиллированную стерильную воду в объеме, идентичном тому, что получали МФ в суспензии с НА.

Иммуноцитохимическое исследование МФ проводили непрямым иммуноцитохимическим методом. Для исследования экспрессии ферментов в МФ культуры МФ фиксировали 4 % водным раствором нейтрального формалина, демаскирование исследуемых ферментов проводили тритоном Х-100 (0,3 % раствор в фосфатном буфере, pH = 7,2). Экспрессию и секрецию МФ трансформирующего фактора роста (TGFB1/TGF-бета), эпидермального фактора роста (EGF), фактора роста кератиноцитов (KGF/FGF7) и основного фактора роста фибробластов (bFGF/FGF2) выявляли при помощи моноклональных антител: anti-TGFB1 / TGF Beta (Rabbit polyclonal antibody, LS-B5663-50; LifeSpan BioSciences, США); anti-EGF (Mouse monoclonal antibody, LS-B5663-50; LifeSpan BioSciences, США); anti-KGF/FGF7 (Rabbit polyclonal antibody, bs-0734R; Bioss, США); anti-bFGF/FGF2 (Rabbit polyclonal antibody, bs-0217R; Bioss, США). Для визуализации кроличьих первичных антител использовали полимерную систему ImmPRESS Anti-Rabbit Ig (peroxidase) Polymer Detection Kit – Vector Labs MP-7401-15 (США). Для визуализации мышиных первичных антител использовали полимерную систему ImmPRESS Anti-Mouse Ig (peroxidase) Polymer Detection Kit – Vector Labs MP-7402-15 (США). Окраску препаратов проводили в растворе диаминобензидина (DAB) с субстратом, содержащим Н2О2, при использовании набора ImmPACTDAB-Kit (Vectorlabs, США).

Уровни экспрессии ферментов МФ в культурах определяли по количеству МФ, высокоэкспрессирующих TGFB1/TGF-бета, EGF, KGF/FGF7 и bFGF/FGF2 – доле МФ в %, у которых более половины цитоплазмы имела ярко выраженную хромогенную окраску. Поскольку экспрессия исследуемых факторов в той или иной степени выявлялась во всех МФ, то количественный анализ экспрессии TGFB1/TGF-бета, EGF, KGF/FGF7 и bFGF/FGF2 во всех исследуемых популяциях МФ в контрольной и экспериментальной группах проводили при помощи компьютерной морфометрии. Зоны цитоплазмы, содержащие выявляемые ферменты, окрашивались в коричневый цвет. Размеры окрашенных зон цитоплазмы МФ оценивали морфометрически в условных единицах по общей площади (в кв. пикселях) окрашенных зон (на пяти микрофотографиях, в которых размещалось от 50 до 70 МФ) после их фотографирования в микроскопе «AxioVision Z1» (Zeiss, Германия) при увеличении в 400 раз и с помощью морфометрического анализа цифровых откалиброванных изображений при помощи программы «ВидеоТест Морфо 3.2» (С.-П.). Далее производили расчет средней площади окрашенных зон цитоплазмы в пересчете на один МФ (в условных единицах).

Исследование влияния НА (в дозе 20 мкг/мл в культуральной среде) на секрецию МФ TGFB1/TGF-бета, EGF, KGF/FGF7 и bFGF/FGF2 проводили при помощи метода культивирования МФ на нитроцеллюлозных миллипоровых фильтрах, применяемых для иммобилизации белков и других биомакромолекул. Определение секреторной активности МФ проводили через 24 и 48 часов после внесения НА в первичные 24-часовые культуры МФ. Эксперименты по оценке секреторной активности МФ в отношении исследуемых ферментов проводили по той же схеме, которую использовали для определения их экспрессии в МФ. Для этого в чашки Петри (диаметром 40 мм) предварительно (до эксплантации МФ в культуру) вносили не покровные стекла, а миллипоровые мембраны стандартных размеров (10×10 мм). Все последующие операции с МФ, прикрепившимися к миллипоровым мембранам, были аналогичны тем, которые проводили с покровными стеклами. Определение секреторной активности МФ осуществляли иммуноцитохимическим методом. После завершения экспериментов in vitro мембраны с МФ отмывали в растворе Хенкса без фенолового красного, а затем проводили иммуноцитохимическую окраску. Зоны мембран вокруг МФ, секретирующих выявляемые ферменты, окрашивались в специфический коричневый цвет. Размеры окрашенных зон на мембранах измеряли морфометрически в условных единицах по общей площади (в кв. пикселях) окрашенных зон на тестируемых мембранах (на 5-ти фотографиях) после их фотографирования в микроскопе AxioVision Z1 (Zeiss, Германия) при увеличении в 400 раз и с помощью цитометрического анализа цифровых откалиброванных изображений при помощи программы «ВидеоТест Морфо 3.2» (С.-П.).

Статистическую обработку результатов исследования проводили методами вариационной статистики. Данные представлены в виде средних арифметических величин и ошибок средних величин. Вероятность достоверности различий сравниваемых средних величин осуществляли с помощью непараметрического критерия Манна ‒ Уитни. Для статистической обработки результатов исследования использовали пакет прикладных программ «Statistica 7.0» (StatSoft. Inc., 2004).

Результаты исследования и их обсуждение

Согласно данным, представленным в табл. 1, культивирование перитонеальных МФ в культуральной среде, содержащей суспензии частиц НА, приводило к увеличению количества МФ, высокоэкспрессирующих EGF, TGFB1/TGF-бета и KGF/FGF7 через 24 часа после внесения НА в культуры клеток.

Примечательно, что доля МФ, экспрессирующих каждый из исследованных факторов, не изменялась в первые два периода культивирования (через 1 и 3 часа). Количество МФ, экспрессирующих bFGF/FGF2, несколько увеличивалось по мере увеличения времени культивирования, но, видимо, не в связи с захватом ими НА. Вероятно, это было обусловлено неспецифической активацией МФ, обусловленной их «реакцией» на пластиковую поверхность, к которой они прикреплялись, а также захватом каких-то компонентов среды для культивирования, например, фетальной сыворотки. Что касается изменения количества МФ, экспрессирующих другие факторы роста, то фактор влияния продолжительности контакта МФ с культуральной средой был менее очевиден. При этом время пребывания МФ в среде с НА в связи с продолжительностью воздействия НА на МФ оказалось доминирующим в «запуске» механизмов активации МФ и проявлялось повышением количества МФ, экспрессирующих факторы роста: EGF, TGFB1/TGF-бета и KGF/FGF7. Согласно этим данным складывается впечатление, что не только «нагрузка» вакуолярного аппарата МФ частицами НА, но и время пребывания НА в МФ (в связи с невозможностью переваривания) «стимулирует» активацию МФ.

Согласно данным «морфометрической» оценки экспрессии факторов роста МФ в различных экспериментальных группах (табл. 2) они по закономерностям изменений практически «совпали» с закономерностями изменений величин показателей их экспрессии МФ, которую определяли на основе оценки количества высокоэкспрессирующих МФ клеток (табл. 1).

Таблица 1

Результаты исследования in vitro влияния наноразмерных алмазов (НА) на изменения количества (%) макрофагов (МФ) в культуре, высокоэкспрессирующих EGF, TGFB1/TGF-бета, KGF/FGF7 и bFGF/FGF2 (M ± m)

Примечание. Степень различий сравниваемых средних величин показателей в группах «МФ без НА» (контроль) и «МФ + НА» на соответствующие сроки культивирования представлены в виде * Р < 0,05, ** Р < 0,01. Обозначения: МФ – макрофаги; НА – наноалмазы.

Таблица 2

Результаты исследования in vitro влияния наноразмерных алмазов (НА) на экспрессию макрофагами (МФ) EGF, TGFB1/TGF-бета, KGF/FGF7 и bFGF/FGF2 (M ± m)

Примечание. Степень различий сравниваемых средних величин показателей в группах «МФ без НА» (контроль) и «МФ + НА» на соответствующие сроки культивирования представлены в виде * Р < 0,05, ** Р < 0,01. Обозначения: МФ – макрофаги; НА – наноалмазы.

Единственное отличие было выявлено при исследовании морфометрическим методом экспрессии bFGF/FGF2. В течение 24 часов после воздействия НА частиц на МФ не было выявлено какого-либо их влияния на экспрессию bFGF/FGF2 в МФ. Через 48 часов культивирования было отмечено увеличение показателя экспрессии bFGF в МФ контрольной группы. При этом показатель экспрессии этого фактора в экспериментальной группе был ниже в 2,2 раза. Таким образом, в данном эксперименте был выявлен эффект своего рода «блокады» продукции b-FGF/FGF2 МФ после воздействия НА.

Представляется полезным исследовать, в какой мере увеличение доли МФ, экспрессирующих исследованные факторы, может быть связано с их секрецией. В связи с этим нами было проведено исследование влияния НА не только на внутриклеточную экспрессию МФ EGF, TGFB1/TGF-бета, KGF/FGF7 и bFGF/FGF2, но и на их секрецию. Поскольку при изучении всех перечисленных факторов, за исключением bFGF/FGF2, их экспрессия в МФ после воздействия НА заметно возрастала через 24 часа, то изучение их секреции проводили именно через этот период времени после введения в среду для культивирования НА (табл. 3). Величина показателя секреции EGF возрастала в экспериментальной группе через 24 часа после воздействия НА по сравнению с контролем в 5,3 раза. Величина показателя секреции TGFB1/TGF-бета возрастала в экспериментальной группе через 24 часов после воздействия НА по сравнению с контролем в 9,2 раза. НА, хотя и приводили к значительному повышению экспрессии KGF/FGF7 в МФ, но не влияли на уровень внеклеточной секреции этого фактора.

Таблица 3

Результаты исследования in vitro влияния наноразмерных алмазов (НА) на секрецию макрофагами (МФ) EGF, TGFB1/TGF-бета, KGF/FGF7 и bFGF/FGF2 при «сокультивировании» в течение 24 часов (M ± m)

Примечание. Степень различий сравниваемых средних величин показателей в группах «МФ без НА» (контроль) и «МФ + НА» на соответствующие сроки культивирования представлены в виде * Р < 0,05, ** Р < 0,01. Обозначения: МФ – макрофаги; НА – наноалмазы.

Величины показателей секреции bFGF/FGF2 в контрольной и экспериментальной группах не различались (табл. 1). Таким образом, полученные данные указывают на способность НА активировать МФ и модулировать их функциональное состояние, изменяя их прорегенераторный потенциал, обусловленный стимуляцией продукции и секреции таких важных в репаративных процессах ростовых факторов, как EGF и TGFB1/TGF-бета. Поскольку доля МФ, экспрессирующих KGF/FGF7, возрастала уже на ранних сроках после воздействия НА (на 3-й час культивирования), то можно предположить, что и стимуляция секреторного процесса НА в отношении этого ростового фактора могла происходить несколько раньше выбранного для исследования секреторного процесса периода времени.

В нашем исследовании в рамках выбранной экспериментальной модели не было выявлено эффекта стимуляции МФ экспрессии и секреции фактора роста фибробластов (bFGF/FGF2) в ответ на воздействие НА. Эти данные согласуются с данными других исследователей [7–10], указывающих или на отсутствие или на слабо выраженную профиброгенную активность НА (различных производителей НА) в экспериментах in vivo, в отличие от наночастиц другой физико-химической природы, существенно повышающих продукцию активных форм кислорода и обладающих в связи с этим (а также с другими особенностями НА) высокой цитотоксичностью и профиброгенной активностью. Полученные нами данные указывают на то, что продукция bFGF/FGF2 МФ и продукция других исследованных факторов роста в ответ на воздействие относительно химически инертных НА может быть обусловлена «запуском» некоего сигнального пути активации МФ, природу которого еще предстоит исследовать.

Заключение

Полученные результаты свидетельствуют о «способности» НА модулировать функциональную активность МФ, что может опосредованно, при попадании НА в организм, в значительной степени модулировать процессы репаративной регенерации как в системе соединительной ткани, так, возможно, и в паренхиме органов при их повреждении.

Работа выполнена при использовании оборудования Центра коллективного пользования научным оборудованием «Современные оптические системы» Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной и клинической медицины».

Усынин И.Ф., д.б.н., зав. лабораторией молекулярной биологии клетки, ФГБУ «Научно-исследовательский институт биохимии», г. Новосибирск;

Бгатова Н.П., д.б.н., профессор, зав. лабораторией ультраструктурных исследований, ФГБУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии», г. Новосибирск.

Работа поступила в редакцию 06.03.2015.