В последнее время значительно возросло значение полисахаридов для медицинской и фармацевтической практики. Фитопрепараты на основе полисахаридов применяют в качестве отхаркивающих и противовоспалительных средств [1, 5], известны их обволакивающие и мягчительные свойства [9], антигипоксическое, антиоксидантное, гепатопротекторное и радиопротекторное действие [8]. Некоторые полисахариды оказались эффективными антиульцерогенными агентами [4]. Многие исследователи связывают с полисахаридами иммуномодулирующие свойства растений и фитопрепаратов на их основе [6, 7]. В литературе есть данные о противоопухолевой активности полисахаридов [4], а также сведения об их способности восстанавливать работоспособность, что активно используется в спортивной медицине [4].
Широкий спектр фармакологической активности полисахаридов обуславливает необходимость разработки и совершенствования методов их анализа.
Цель настоящей работы – разработка методики количественного определения полисахаридов в траве кульбабы осенней и ее валидация.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования служила трава кульбабы осенней, заготовленная на территории Курской области в 2013–2014 г. в период массового цветения растений.
Наиболее доступным и распространенным методом для анализа растительного сырья, содержащего полисахариды, является гравиметрический метод, основанный на экстракции суммы полисахаридов из сырья с последующим осаждением их спиртом этиловым 96 % [2, 3].
Поэтому нами для анализа травы кульбабы осенней разработана методика гравиметрического определения полисахаридов. При этом изучены такие стадии, как экстрагирование суммы полисахаридов и условия осаждения полисахаридов.
Статистическую обработку полученных данных вели по общепринятой методике с использованием t-критерия Стьюдента [3], а также с помощью программы Microsoft Excel 2010.
Результаты исследования и их обсуждение
При установлении количественного содержания полисахаридов в траве кульбабы осенней нами изучены и выявлены оптимальные условия анализа: степень измельченности сырья, время экстракции, температура экстракции, типа экстрагента, соотношение сырье-экстрагент (табл. 1).
Таблица 1
Влияние условий экстракции на содержание полисахаридов в траве кульбабы осенней
|
Условия экстракции |
Содержание полисахаридов в % |
|
1 |
2 |
|
Время экстракции, мин 30 60 (2х30) 90 (3х30) 120 (4х30) |
4,23 6,16 9,19 9,68 |
|
Степень измельчения, мл 1,0 2,0 3,0 |
9,68 4,68 4,05 |
|
Соотношение извлечения и спирта 96 % этилового 1:1 1:2 1:3 1:4 |
3,89 6,60 9,68 9,77 |
Было установлено, что наиболее полное извлечение полисахаридов из травы кульбабы осенней достигается при использовании четырехкратной экстракции по 30 минут со степенью измельчения сырья 1,0 мм и при соотношении извлечения и спирта этилового 96 % 3:1.
На основании проведенных исследований разработана методика количественного суммы полисахаридов в траве кульбабы осенней.
Количественное определение полисахаридов в траве кульбабы осенней. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм. Около 10,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл воды очищенной, колбу присоединяют к обратному холодильнику и кипятят при перемешивании на электрической плитке в течение 30 минут. Экстракцию повторяют трижды, прибавляя по 100 мл воды очищенной в течение 30 минут каждый раз. Водные извлечения объединяют, центрифугируют с частотой вращения 5000 об/мин в течение 10 минут и декантируют в мерную колбу вместимостью 500 мл через 5 слоев марли, вложенной в стеклянную воронку диаметром 66 мм и предварительно смоченной водой. Фильтр промывают водой и доводят объем раствора водой до метки (раствор А).
25 мл раствора А помещают в центрифужную пробирку, прибавляют 75 мл 96 % спирта этилового, перемешивают, подогревают на водяной бане при температуре 60 °С в течение 5 минут. Через 30 минут содержимое центрифугируют с частотой вращения 5000 об/мин в течение 30 минут.
Надосадочную жидкость фильтруют под вакуумом при остаточном давлении 13–16 кПа через высушенный до постоянной массы при температуре 100–105 °С стеклянный фильтр ПОР 16 диаметром 40 мм. Затем осадок количественно переносят на тот же фильтр и промывают 15 мл смеси спирта этилового 96 % и воды (4:1). Фильтр с осадком высушивают сначала на воздухе, затем при температуре 100–105 °С до постоянной массы.
Содержание полисахаридов в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле
,
где m1 – масса фильтра, г;
m2 – масса фильтра с осадком, г;
m – масса сырья, г;
w – потеря в массе при высушивании сырья, %.
Валидацию методики количественного определения проводили по показателям: линейности, повторяемости и воспроизводимости [11].
Для установления диапазона использования методики получали извлечения различной концентрации. Для этого согласно разработанной методике получали извлечения из навесок массой 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 10,0 г (точные навески). Градуировочный график представлен на рисунке.
Критерием приемлемости линейности является коэффициент корреляции. Если его величина близка к единице, то совокупность данных можно описать прямой линией.
На основании полученных результатов установлено, что в пределах измеряемых концентраций зависимость содержания полисахаридов от массы навески носит линейный характер (рисунок и табл. 2).
Коэффициент корреляции составил 0,999964, что свидетельствует о том, что данную методику можно использовать для анализа полисахаридов в указанном диапазоне концентраций.
Повторяемость методики определяли на одном образце сырья в 6 повторностях. Критерий приемлемости выражался величиной относительного стандартного отклонения, который составил 4,03 % (табл. 3), что свидетельствует о прецизионности методики в условиях повторяемости.
Воспроизводимость определяли 2 аналитика на 3 образцах в 3 повторностях. Относительное стандартное отклонение не превышало 6,95, что свидетельствует о прецизионности методики в условиях воспроизводимости (табл. 4).
Зависимость содержания суммы полисахаридов от массы навески сырья
Таблица 2
Результаты статистической обработки данных, полученных при изучении линейной зависимости вида у = bx + a
|
F |
|
|
b |
a |
R |
|
3 |
0,0325 |
6.00032 |
181,0267 |
0,116953 |
0,999964 |
Таблица 3
Содержание полисахаридов в траве кульбабы осенней
|
№ п/п |
Содержание полисахаридов, % |
Метрологические характеристики |
|
1 |
9,54 |
Хср = 9,69 Sx2 = 0,02331 Sxcp = 0,1527 ∆x = 0,39 Eотн = 4,03 Хср + ∆xср = 9,69 + 0,39 |
|
2 |
9,86 |
|
|
3 |
9,66 |
|
|
4 |
9,59 |
|
|
5 |
9,57 |
|
|
6 |
9,89 |
Таблица 4
Определение воспроизводимости разработанной методики
|
Повторность |
Аналитик |
Содержание суммы полисахаридов в траве кульбабы осенней ( %) |
||
|
Образец № 1 |
Образец № 2 |
Образец № 3 |
||
|
1 |
1 |
9,54 |
9,40 |
9,96 |
|
2 |
1 |
9,86 |
9,53 |
10,16 |
|
3 |
1 |
9,66 |
9,31 |
9,71 |
|
4 |
2 |
9,59 |
9,02 |
10,42 |
|
5 |
2 |
9,57 |
8,86 |
10,24 |
|
6 |
2 |
9,89 |
9,15 |
10,15 |
|
Среднее значение |
9,69 |
9,21 |
10,11 |
|
|
Погрешность измерения (∆Х) |
± 0,39 |
± 0,64 |
± 0,63 |
|
|
Относительное стандартное отклонение, (RSD) |
4,03 |
6,95 |
6,23 |
|
По разработанной методике изучали содержание полисахаридов в траве кульбабы осенней, собранной в различных годах и местах произрастания (табл. 5).
Таблица 5
Содержание суммы водорастворимых полисахаридов в траве кульбабы осенней
|
Место и год сбора сырья |
Содержание полисахаридов, % |
|
Курская область, окрестности г. Курска, 2013 г. |
9,69 ± 0,39 |
|
Курская область, окрестности г. Курска, 2014 г. |
9,21 ± 0,64 |
|
Курская область, Курский район, 2014 г. |
10,11 ± 0,63 |
Анализируя данные таблицы, можно отметить, что в траве кульбабы осенней содержание полисахаридов колеблется от 8,57 % до 10,74 % .
Выводы
1. Нами впервые разработана методика гравиметрического определения полисахаридов в траве кульбабы осенней (Leontodon autumnalis L.). Содержание суммы полисахаридов в сырье кульбабы осенней колеблется от 8,57 % до 10,74 %.
2. Проведена валидация разработанной методики по показателям линейности, повторяемости и воспроизводимости.
Рецензенты:Раздорская И.М., д.фарм.н., профессор, заведующая кафедрой управления и экономики фармации ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России, г. Курск;
Сипливая Л.Е., д.б.н., профессор, заведующая кафедрой фармацевтической, токсикологической и аналитической химии ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России, г. Курск.
Работа поступила в редакцию 02.02.2015.