В результате проведенных ранее исследований стало известно, что тромбоциты и сосудистая стенка в онтогенезе тесно функционально связаны между собой, определяя агрегатное состояние крови у различных продуктивных животных, в т.ч. крупного рогатого скота [2, 6, 9]. Сбалансированность функциональной активности компонентов первичного гемостаза является основой адекватности гемостатического процесса в условиях in vivo и тем самым оптимум жидкостных свойств крови в микроциркуляторном русле и достаточность кровоснабжения всех тканей животного в течение всей жизни [1, 3, 12, 15]. Наибольшее значение клеточно-гемостатические взаимоотношения имеют в период беременности, когда растущий плод нуждается в интенсивном обеспечении кислородом и питательными веществами, что во многом зависит от состояния первичного гемостаза в материнском организме [14].
Весьма важное хозяйственное значение имеет комплексная оценка сосудисто-тромбоцитарных взаимодействий у крупного рогатого скота – важного источника мясо-молочной продукции для населения России и всего мира [13]. При этом состояние функциональной готовности тромбоцитов и сосудов к участию в процессах гемостаза у коров в течение стельности остается изучено весьма слабо, несмотря на их большую роль в обеспечении оптимума состояния жизненно важных систем плода, и является одной из важных точек приложения корректирующего воздействия в случае формирования у животных патологии [2, 5]. Учитывая крайнюю физиологическую и экономическую важность процесса вынашивания потомства у крупного рогатого скота и слабую изученность активности системы первичного гемостаза на его протяжении, было принято решение провести оценку функциональных возможностей тромбоцитарного и сосудистого компонентов гемостаза у здоровых коров от осеменения до окончания стельности.
В этой связи в настоящей работе сформулирована цель: выяснить физиологические особенности тромбоцитарного и сосудистого гемостаза у здоровых коров в течение нормальной стельности.
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на 47 здоровых стельных коровах черно-пестрой породы, которые осматривались и обследовались 7 раз: в день осеменения, на 45-е, 90-е, 135-е, 180-е, 230-е и 280-е сутки стельности.
Уровень функциональной активности тромбоцитарного гемостаза у наблюдаемых коров оценивался по состоянию агрегации тромбоцитов (АТ) [10] в ответ на ряд индукторов АДФ (0,5×10-4 М), коллагена (разведение 1:2 основной суспензии), тромбина (0,125 ед/мл), ристомицина (0,8 мг/мл) (НПО «Ренам»), Н2О2 (7,3×10-3 М), адреналина (5,0×10-6 М. Завод Гедеон Рихтер А.О.) и сочетания индукторов: АДФ и адреналина; АДФ и коллагена; коллагена и адреналина; АДФ и тромбина в аналогичных концентрациях со стандартизированным количеством тромбоцитов в исследуемой плазме 200×109 тр.
Состояние обмена эндогенной арахидоновой кислоты (АА) в кровяных пластинках и функциональные возможности их циклооксигеназы (ЦО) и тромбоксансинтетазы (ТС) определялись в трех пробах переноса с регистрацией агрегации тромбоцитов на фотоэлектроколориметре [1].
В работе проведена количественная оценка содержания в тромбоцитах АТФ и АДФ, выяснялась выраженность их секреции под действием индуктора (коллагена) и устанавливались особенности белкового состава цитоскелета кровяных пластинок (актина и миозина) [1].
Функциональные свойства сосудистого гемостаза у животных определялись по ее антиагрегационной активности сосудистой стенки, регистрируемой по АТ до и после временной венозной окклюзии со всеми индукторами и их сочетаниями при расчете значения индекса антиагрегационной активности стенки сосуда (ИААСС) путем деления длительности АТ на фоне венозного застоя на время возникновения АТ без него [7].
Результаты исследований обработаны критерием (td) Стьюдента.
Результаты исследований и их обсуждение
В крови у здоровых стельных коров регистрировалось нормальное количество тромбоцитов. На момент осеменения у коров время развития АТ под влиянием коллагена составляло 22,9 ± 0,16 с, несколько замедляясь к 135-м суткам стельности и в последующем удлиняясь дополнительно к ее концу (27,9 ± 0,19 с). Аналогичная динамика АТ у наблюдаемых животных в течение стельности отмечена под влиянием АДФ (удлинилась на 15,1 %) и ристомицина (удлинилась на 13,9 %), несколько замедленно развивались тромбиновая (удлинилась на 11,3 %) и адреналиновая (удлинилась на 7,5 %) АТ. Агрегация тромбоцитов со всеми испытанными физиологическими сочетаниями индукторов у наблюдаемых стельных животных также постепенно замедлялась по сравнению с показателями, свойственными для момента осеменения (таблица).
Серьезным механизмом, реализующим торможение процесса агрегации тромбоцитов у стельных коров, является найденное у них выраженное ослабление интенсивности обмена АА в кровяных пластинках с постепенным уменьшением тромбоксанообразования, о чем косвенно можно было судить по АТ в простой пробе переноса (снижение на 29,0 %). Данная динамика обеспечивалась постепенным одновременным ослаблением у них активности обоих ферментов ее превращения в тромбоцитах – ЦО и ТС. Степень восстановления АТ в коллаген-аспириновой пробе, косвенно оценивающей активность ЦО в тромбоцитах, за время стельности снижалась на 8,2 %, составляя к ее концу 81,8 ± 0,36 %. Восстановление АТ в коллаген-имидазольной пробе, позволяющей косвенно определить функциональную активность ТС в кровяных пластинках, постепенно снижалось у наблюдаемых коров на 18,1 %, достигая 42,6 ± 0,17 % на 280 сутки стельности.
Изначально невысокое содержание АТФ и АДФ в тромбоцитах здоровых коров постепенно понижалось в течение стельности с 5,87 ± 0,07 мкмоль/109 тр. до 5,58 ± 0,13 мкмоль/109 тр. и с 3,71 ± 0,11 мкмоль/109 тр. до 3,39 ± ± 0,15 мкмоль/109 тр. соответственно. При этом, их уровень секреции из тромбоцитов испытывал аналогичную динамику, понижаясь с 42,7 ± 0,26 % и 52,7 ± 0,24 % на момент осеменения до 37,6 ± 0,24 % и 47,8 ± 0,23 % к концу стельности соответственно.
Количество актина и миозина в интактных тромбоцитах у коров на момент осеменения составляло 37,8 ± 0,19 % и 18,5 ± 0,12 % к общему белку в тромбоцитах, постепенно снижаясь к 280 суткам стельности до 32,6 ± 0,25 % и 16,3 ± 0,09 % к общему белку в тромбоцитах.
У находившихся под наблюдением здоровых коров в течение стельности выявлено усиление контроля сосудистой стенкой над АТ. Наиболее высокий ИААСС регистрировался с АДФ. Несколько меньший уровень ИААСС выявлен для коллагена и адреналина. ИААСС для тромбина и ристомицина в абсолютных значениях были еще ниже. Достаточно высокие ИААСС для сочетаний индукторов также испытывали тенденцию к росту в течение стельности (таблица).
Показатели сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у стельных коров
|
Учитываемые показатели |
Стельность, n = 47, M ± m |
||||||
|
осеменение |
45 сут. |
90 сут. |
135 сут. |
180 сут. |
230 сут. |
280 сут. |
|
|
Агрегация с АДФ, с |
31,9 ± 0,18 |
32,0 ± 0,22 |
32,8 ± 0,20 |
33,8 ± 0,19 |
35,0 ± 0,23 |
36,1 ± 0,26 |
37,6 ± 0,24 |
|
Агрегация с коллагеном, с |
22,9 ± 0,16 |
23,0 ± 0,14 |
23,6 ± 0,18 |
24,8 ± 0,21 |
25,7 ± 0,24 |
26,8 ± 0,23 |
27,9 ± 0,19 |
|
Агрегация с тромбином, с |
44,6 ± 0,12 |
44,7 ± 0,20 |
45,1 ± 0,16 |
46,1 ± 0,27 |
47,7 ± 0,29 |
49,0 ± 0,31 |
50,3 ± 0,26 |
|
Агрегация с ристомицином, с |
39,6 ± 0,19 |
39,8 ± 0,15 |
40,6 ± 0,21 |
41,8 ± 0,24 |
42,7 ± 0,28 |
44,3 ± 0,23 р < 0,05 |
46,0 ± 0,24 р < 0,05 |
|
Агрегация с Н2О2, с |
33,2 ± 0,18 |
33,4 ± 0,16 |
34,6 ± 0,14 |
35,9 ± 0,17 |
37,1 ± 0,23 |
38,6 ± 0,21 р < 0,05 |
39,8 ± 0,27 р < 0,05 |
|
Агрегация с адреналином, с |
86,4 ± 0,31 |
86,7 ± 0,27 |
87,5 ± 0,25 |
89,2 ± 0,29 р < 0,05 |
90,6 ± 0,32 |
91,4 ± 0,35 |
93,4 ± 0,37 р < 0,05 |
|
Агрегация с АДФ и адреналином, с |
29,2 ± 0,16 |
29,4 ± 0,17 |
30,4 ± 0,12 |
31,7 ± 0,15 |
32,8 ± 0,17 |
33,9 ± 0,12 |
35,6 ± 0,19 р < 0,05 |
|
Агрегация с АДФ и коллагеном, с |
20,4 ± 0,12 |
20,5 ± 0,14 |
21,4 ± 0,16 |
22,3 ± 0,09 |
23,4 ± 0,13 |
24,5 ± 0,15 |
25,7 ± 0,23 |
|
Агрегация с адреналином и коллагеном, с |
21,2 ± 0,11 |
21,3 ± 0,17 |
22,6 ± 0,22 |
23,5 ± 0,18 |
24,4 ± 0,15 |
25,6 ± 0,20 |
27,2 ± 0,18 р < 0,05 |
|
Агрегация с АДФ и тромбином, с |
20,7 ± 0,12 |
20,8 ± 0,15 |
21,6 ± 0,13 |
23,2 ± 0,15 |
24,6 ± 0,17 |
26,0 ± 0,22 р < 0,05 |
28,1 ± 0,14 р < 0,05 |
|
ИААСС с АДФ |
1,89 ± 0,12 |
1,89 ± 0,08 |
1,91 ± 0,06 |
1,93 ± 0,07 |
1,94 ± 0,09 |
1,96 ± 0,05 |
1,98 ± 0,08 |
|
ИААСС с коллагеном |
1,77 ± 0,06 |
1,77 ± 0,04 |
1,78 ± 0,07 |
1,80 ± 0,05 |
1,82 ± 0,09 |
1,84 ± 0,07 |
1,87 ± 0,04 р < 0,05 |
|
ИААСС с тромбином |
1,64 ± 0,10 |
1,64 ± 0,07 |
1,65 ± 0,08 |
1,67 ± 0,09 |
1,69 ± 0,10 |
1,71 ± 0,08 |
1,74 ± 0,12 р < 0,05 |
|
ИААСС с ристомицином |
1,66 ± 0,06 |
1,67 ± 0,04 |
1,68 ± 0,07 |
1,70 ± 0,04 |
1,72 ± 0,07 |
1,74 ± 0,09 |
1,77 ± 0,06 р < 0,05 |
|
ИААСС с Н2О2 |
1,75 ± 0,10 |
1,76 ± 0,12 |
1,78 ± 0,06 |
1,81 ± 0,07 р < 0,05 |
1,84 ± 0,04 р < 0,05 |
1,87 ± 0,08 р < 0,05 |
1,91 ± 0,11 р < 0,05 |
|
ИААСС с адреналином |
1,77 ± 0,11 |
1,78 ± 0,06 |
1,80 ± 0,08 |
1,83 ± 0,07 р < 0,05 |
1,86 ± 0,05 р < 0,05 |
1,90 ± 0,06 р < 0,05 |
1,93 ± 0,09 р < 0,05 |
|
ИААСС с АДФ и адреналином |
1,58 ± 0,03 |
1,59 ± 0,05 |
1,62 ± 0,04 р < 0,05 |
1,64 ± 0,08 |
1,67 ± 0,10 р < 0,05 |
1,70 ± 0,09 р < 0,05 |
1,74 ± 0,07 р < 0,05 |
|
ИААСС с АДФ и коллагеном |
1,49 ± 0,10 |
1,50 ± 0,06 |
1,53 ± 0,08 р < 0,05 |
1,54 ± 0,08 |
1,56 ± 0,09 |
1,59 ± 0,10 р < 0,05 |
1,61 ± 0,12 |
|
ИААСС с адреналином и коллагеном |
1,62 ± 0,12 |
1,62 ± 0,07 |
1,64 ± 0,08 |
1,66 ± 0,05 |
1,68 ± 0,04 |
1,70 ± 0,05 |
1,73 ± 0,10 р < 0,05 |
|
ИААСС с АДФ и тромбином |
1,49 ± 0,05 |
1,49 ± 0,03 |
1,52 ± 0,10 |
1,54 ± 0,06 |
1,56 ± 0,08 |
1,59 ± 0,07 р < 0,05 |
1,63 ± 0,10 р < 0,05 |
Примечание. Условные обозначения: р – достоверность возрастной динамики учитываемых показателей.
Весьма биологически значимой интегративной системой организма крупного рогатого скота является система крови, жидкостные свойства которой регулируются гемостазом [4, 12]. Именно от оптимальной его активности в течение стельности во многом зависят реологические свойства крови и тем самым оптимум роста и развития плода [14]. При этом анализ уровня активности тромбоцитарного, сосудистого и коагуляционного гемостаза и тонкие механизмы их реализации у здоровых стельных коров изучены недостаточно.
Оценка времени агрегации тромбоцитов под действием ряда индукторов и большого числа их физиологических сочетаний позволила установить с момента осеменения по 280 сутки стельности у коров ослабление чувствительности к ним тромбоцитов. Выяснено, что аналогичную динамику испытывает у них адгезивная способность кровяных пластинок, вероятно, вследствие понижения концентрации в их крови фактора Виллебранда (ФВ) – кофактора адгезии тромбоцитов, что, видимо, сочетает со снижением числа рецепторов к нему – (GPI в) на поверхности кровяных пластинок [1]. Динамика уровня ФВ у стельных коров была установлена на основе постепенного торможения у них агрегации тромбоцитов с ристомицином, который по своей способности влиять на тромбоциты, идентичен субэндотелиальным структурам сосудов. Прикрепляясь одним концом молекулы к коллагену, а другим к тромбоциту через гликопротеид Iв, ФВ формирует «ось адгезии»: коллаген – ФВ – GPIв [11]. Это позволяет говорить о снижении в течение стельности числа этих рецепторов на тромбоцитарных мембранах у коров.
Ослабление выраженности чувствительности тромбоцитов к различным агонистам агрегации и их сочетаниям, вероятно, также связано с уменьшением экспрессии фибриногеновых рецепторов (GPIIв-IIIа), уровня стимуляции фосфолипаз А2 и С, интенсивности тромбоксанообразования, актино- и миозинообразования и секреции аденозинфосфатов из кровяных пластинок в течение стельности [8].
Выявленная тенденция к усилению антиагрегационной активности стенки сосудов у стельных коров объясняется усилением синтеза в ней простациклина и NO [9, 11], обеспечивающим необходимый уровень микроциркуляции в тканях плаценты.
Таким образом, осуществленная оценка состояния сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у коров после успешного осеменения свидетельствует о существовании закономерности в динамике у них активности отдельных его компонентов по мере увеличения срока стельности. Так, в течение стельности у коров отмечается ослабление активности тромбоцитарного и усиление сосудистого компонента гемостаза, обеспечивая необходимые жидкостные свойства крови и тем самым способствуя формированию оптимальных условий для анаболизма в тканях плода.
Рецензенты:Грушкин А.Г., д.б.н., профессор кафедры ветеринарии и физиологии животных Калужского филиала РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, г. Калуга;
Смахтин М.Ю., д.б.н., профессор, профессор кафедры биохимии Курского государственного медицинского университета, г. Курск.
Работа поступила в редакцию 04.02.2015.